探讨在ۥ高海拔地区应用血液基因组DNA提取试剂盒的最佳条件.doc

讨论在高海拔地区应用血液基因组DNA提取试剂盒的最正确条件

讨论在高海拔地区应用血液基因组DNA提取试剂盒的最正确条件 本文关键词：基因组，提取，血液，试剂盒，讨论

讨论在高海拔地区应用血液基因组DNA提取试剂盒的最正确条件 本文内容：

摘要：目的 讨论在高海拔地区应用血液基因组DNA提取试剂盒的最正确条件。方法应用RelaxGene Blood DNA System血液基因组DNA提取系统， 对109份血样 （每份血样分为2组， 实验组和对照组） 提取DNA, 实验组采纳优化条件提取DNA、对照组采纳试剂盒说明书方法提取DNA.结果 实验组109份样品中有13份DNA浓度在2050ng/mu;L之间， 35份在51-80ng/mu;L之间， 61份样品80ng/mu;L;DNA浓度比例高于对照组 （Plt;0.05） .实验组109份样品中DNA纯度OD260/OD280比值在ge;1.7-lt;1.9之内的有105份， 比值小于1.7的有3份， 比值ge;1.9的有1份， DNA纯度比例高于对照组 （Plt;0.05） .结论 在高海拔地区采纳试剂盒提取血液基因组DNA, 需要优化提取条件， 所得到的DNA浓度和纯度均能满足下游实验要求， 且重复性好。

　　关键词：高海拔； DNA提取； 优化；

　　　　The blood genomic DNA extraction kit was optimized in the plateau region

　　Abstract:Objective To explore the optimal conditions for extracting the DNA from blood genomic DNA in the plateau area.Methods RelaxGene Blood DNA System, 109 plasma samples （each Blood sample was pided into 2 groups, experimental group and control group） to extract DNA, DNA extracted with the use of optimal conditions and controls kit manual method to extract DNA.Results 13 of the 109 samples of the experimental group were between 20 and 50 ng/mu;L, 35 were between 51-80 ng/mu;L, and 61 samples were80 ng/mu;L.The concentration of DNA was higher than the control group （Plt;0.05） .The ratio of the DNA purity OD260/OD280 in the experimental group 109 samples was 105 in the sample, and the ratio was less than 1.7.The ratio was less than 1.7, and the ratio was greater than that of the control group （Plt;0.05） .Conclusion Uses reagent box extraction blood genome team DNA in the high elevation area, needs to optimize the extraction condition, obtains the DNA density and the purity can satisfy the downstream experiment to request, also the duplication is good.

　　Keyword:plateau environment; DNA extraction; optimization;

　　全血基因组DNA是科学研究、临床疾病分析及亲子鉴定等许多研究领域不可缺少的原材料。目前， 提取DNA的各类方法较多， 除各实验室有本身独特的方法外， 应用最为广泛的还属商品化的血液基因组提取试剂盒， 不仅使用方便本钱低廉且液体量较少相对污染较低。西藏自治区地处我国西南边疆， 平均海拔在3000米以上， 由于地势高而构成了特有的高原低压低氧、酷寒单调的环境。在高原环境中提取血液基因组可采纳商品化的血液基因组提取试剂盒， 但是假设按照试剂盒中说明书方法进接提取血液基因组其产量和纯度特别难满足后续研究的需要。本课题组通过屡次尝试研究， 探究出了一套血液基因组试剂盒提取DNA的优化方法， 该方法在高原环境下提取的DNA可以获得满意的产量和纯度。

　　1、材料与方法

　　1.1 实验材料

　　2017年5月西藏阜康医院体检的健康体检者的血液样品109份作为基因组DNA提取的材料。

　　1.2 主要试剂与仪器

　　RelaxGene Blood DNA System血液基因组DNA提取系统 （非离心柱型） [天根生化科技 （北京） ], 其产品组成：细胞裂解液CL2250ml, 缓冲液FG 120ml, 洗脱缓冲液TB60ml, 蛋白酶K1ml.其余试剂为分析纯， 水为双蒸灭菌水。

　　高速台式离心机 （Sigma） ;超微量紫外可见分光光度计 （Thermo） .

　　1.3 实验分组

　　将109份血液样品的每一份分为2组：实验组 （109份） 和对照组 （109份） .

　　1.4 实验方法

　　1.4.1 对照组按300mu;l抗凝血750mu;l裂解液提取DNA, 详细的操作方法对照组采纳RelaxGene Blood DNA System血液基因组DNA提取系统试剂盒说明书提取方法。

　　实验组按300mu;l抗凝血900mu;l裂解液提取DNA, 采纳RelaxGene Blood DNA System血液基因组DNA提取系统 （非离心柱型） 试剂盒， 对实验条件和方法进展优化和改良， 其方法是：1） 将抗凝血样 （2ml血液/管） 从-80℃冰箱中， 室温融化， 利用移液器在样品管中把血样充分混匀， 取300mu;l血样置于尖底离心管中并向管中参加750mu;l细胞裂解液CL, 颠倒混匀10次。重复2次。2） 离心12 000rpm 1min、弃上清， 将离心管倒置于洁净吸水滤纸上5min, 如今确保管底沉淀在管中。3） 按100∶1配制FG与蛋白酶K混合液， 现用现配。将混合液按照200mu;l/管的量参加到已弃上清并倒置5 min的EP管内， 立即涡旋混匀至无团块。4） 65℃水浴过夜 （20h） , 最初的2h内每10-15min颠倒混匀2-3次， 并用手指弹匀， 水浴后可见溶液的颜色从红色变为黄绿色。5） 参加异丙醇150mu;l, 涡旋混匀至丝状或簇状DNA为止。6） 离心12 000rpm 5min、弃上清将EP管倒置于洁净的吸水滤纸上、确保沉淀在EP管中、参加150mu;l 70%乙醇、涡旋振荡5s、离心12 000rpm 2 min弃清， 再次重复参加150mu;l70%乙醇、离心弃上清后将EP管倒置于洁净的吸水滤纸上， 15min.6） 参加100mu;lTB缓冲液， 室温过夜 （24h） .

　　1.4.2 DNA浓度、纯度的检测采纳紫外线分光光度法[3].

　　1.5 统计学方法

　　应用SPSS19.0统计软件进展数据处理。计量材料以plusmn;s表示， 组间比拟采纳t检验；各构成比的比拟采纳chi;2检验。以Plt;0.05为差异有统计学意义。

　　2、结果

　　2.1 DNA不同浓度比例比拟

　　实验组109份样品中DNA浓度没有lt;20ng/mu;l, 有13份DNA浓度在20-50ng/mu;l之间， 35份DNA浓度在51-80ng/mu;l之间， 61份样品DNA浓度80ng/mu;l;DNA浓度比例高于对照组见表1.

　　2.2 DNA不同纯度比例比拟

　　实验组109份样品中DNA纯度OD260/OD280比值在ge;1.7-lt;1.9之内的有105份， 比值小于1.7的有3份， 比值ge;1.9的有1份， DNA纯度比例高于对照组见表2.

　　3、讨论

　　临床医学疾病研究、分子生物学、遗传学等流行病学的调查研究都离不开高纯度、高分子量的血液基因组 （DNA） [1-3].现今， DNA的提取方法较多， 也有多种的提取试剂盒可供选择使用。但青藏高原平均海拔较高， 假设使用常规化学方法提取DNA因使用有机溶剂量较多不但运输不便而且也会对环境造成污染。最恰当的方法确实是利用血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA, 不但操作简便而且有机溶剂的使用量也特别小， 并可将获得的DNA直截了当用于下游实验[4].西藏地区地处高原大气压低于平原地区且单调低温对DNA的提取有一定的阻碍， 本课题组在平原地区采纳天根RelaxGene Blood DNA System血液基因组DNA提取系统试剂盒提取DNA, 按照说明书方法操作， 获得的DNA的浓度和纯度均能满足下游实验的需求， 但在西藏大学医学院分子生物学实验室 （拉萨市平均海拔3600米） 采纳说明书方法提取DNA时不管是纯度仍然浓度均无法满足下游实验要求因此通过屡次实验提出了天根DNA提取系统在高原地区使用的改良： （1） 在300微升抗凝血中参加细胞裂解液CL由原来的750mu;l改为800mu;l; （2） 参加蛋白酶K FG混合液后65℃水浴由原来的10min改为过夜 （20h） ; （3） 将说明书上的参加200mu;l TB缓冲液改为100mu;l, 65℃水浴1h改为过夜 （24h） .

　　在高原环境提取DNA的过程中， 首先将-80℃保存的抗凝血室温融化后按照改良方案细胞裂解液使用量为血液的3倍， 颠倒混匀10次使DNA别离出来[5,6];参加蛋白酶K和FG混合液后水浴20h, 样品溶液透明， 推断由于环境要素导致裂解时间延长；参加TB洗脱液后水浴24h后采纳紫外分光光度法检测DNA浓度和纯度。按照文献报道DNA纯度推断标准：纯DNA, 其OD260/OD280比值范围应为1.7-1.9;OD260/OD280比值1.9, 说明有RNA污染；OD260/OD280比值lt;1.6, 说明有蛋白质等污染[7].实验组109份样品中35份DNA浓度在51-80ng/mu;l之间， 61份样品DNA浓度80ng/mu;l;DNA纯度OD260/OD280比值在ge;1.7-lt;1.9之内的有105份， 比值小于1.7的有3份， 比值ge;1.9的有1份， DNA浓度和纯度比例均高于对照组。

　　采纳改良方法在高原地区提取的DNA不管是完好性仍然浓度纯度均能保证后续实验研究的需要同时适宜临床研究及检测应用。

　　参考文献

　　[1]王秀娟， 肖瑞， 张传领， 等。血液基因组DNA试剂盒提取条件的优化[J].疾病监测与操纵杂志， 2015, 12 （9） :855.

　　[2]韩芬霞， 杨丽芬。全血DNA提取方法的改良及PCR检测[J].江苏农业科学， 2012, 40 （8） :56.

　　[3]余凯琳， 邓正栋， 严济。血液基因组DNA提取方法改良[J].南昌大学学报 （医学版） , 2014, 54 （10） :9.

　　[4]袁茂勇， 郭斌， 宋欢， 等。DNA定量分析在宫颈病变筛查中应用价值的研究[J].南昌大学学报：医学版， 2011, 51 （6） :68.

　　[5]刘正旺， 云美玲， 钟江华， 等。提取陈旧血液标本中DNA的三种方法比拟[J].中国热带医学， 2012, 12 （3） :321.

　　[6]许丽娟， 马骁， 王洋阳， 等。一种快速、经济提取外周凝血基因组DNA方法的建立[J].现代生物医学进展， 2011, 11 （20） :3946.

　　[7]段莹， 于卫建。-40℃条件下储存不同时间的全血对提取DNA浓度的阻碍[J].中国输血杂志， 2011, 24 （11） :973.