自发荧光光谱识别高级别胶质瘤边界的应用研究.pdf

:./.论著自发荧光光谱识别高级别胶质瘤边界的应用研究武其嘉冯世宇陈德福李科锐孔东生【摘要】目的 通过内源性荧光团的荧光光谱对高级别胶质瘤肿瘤组织、瘤旁组织与正常脑白质进行鉴别 方法 收集 年 月 年 月在解放军总医院第一医学中心神经外科采用术中导航引导下手术切除的高级别胶质瘤患者的新鲜样本通过 激发光对各样本、脂质、卟啉等内源性荧光团进行光谱测定使用方差分析、多重比较对 类样本进行统计学分析及 曲线分析判断其敏感度与灵敏性结果 肿瘤组织、瘤旁组织与正常脑白质能够两两区分(.)其中区分肿瘤与瘤旁灵敏度、特异性分别为.、.肿瘤与白质的灵敏度、特异性分别为.、.瘤旁与白质的灵敏度、特异性分别为.、.结论自发荧光检测可区分高级别胶质瘤肿瘤组织、瘤旁组织与正常脑白质是一种具有非侵入性、无需标记的方法在术中实时识别高级别胶质瘤边界方面具有广泛的应用前景【关键词】高级别胶质瘤 自发荧光检测 内源性荧光团 生物分子光谱【中图分类号】.【文献标志码】【文章编号】().:.(.).:基金项目:装备综合研究项目基金()作者单位:保定河北大学附属医院神经外科(武其嘉)解放军总医院第一医学中心神经外科医学部(冯世宇孔东生)北京理工大学医工融合研究院(陈德福李科锐)通信作者:孔东生 胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤其中高级别胶质瘤(级和 级)每年的发病率为./万人患者生存时间中位生存期约 年同时肿瘤异质性高肿瘤不同部分组织成分不尽相同 最大程度的安全切除是其首要治疗方式手术切除率与患者预后密切相关 .能否达到肿瘤的全切仍然是预后的独立预测因素 然而由于它浸润性生长的特点肿瘤组织与周围正常脑组织常无明显界限这导致术者在术中难以区分肿瘤边界很难达到最佳的手术切除范围 切除不完全复发率高过度切除则可能产生新的神经功能障碍影响患者的生活质量 因此亟需发展一种术中实时识别高级别胶质瘤边界的新技术生物组织中包含有大量内源性荧光团如细胞外基质的某些蛋白质(胶原蛋白、弹性蛋白等)、还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸()、黄嘌呤二核苷酸()、脂质和卟啉以及各种芳香族氨基酸等 肿瘤组织与正常组织内源性荧光团的荧光强度不同主要与它们的代谢状态或微环境的差异有关 这些荧光团吸收激发光后能够发出特定波长的荧光通过探测器呈现出不同的荧光光谱本研究选取 年 月 年 月在解放军总医院第一医学中心神经外科就诊的 例患者在导航引导下切除肿瘤利用 激发光检测人体新鲜高级别胶质瘤组织、瘤旁组织与正常脑白质并对、脂质及卟啉等自发荧光光谱的相关光学信息进行提取和分析以期为高级别胶质瘤边界的识别方面提供数据支持 资料与方法.一般资料共收集 例符合标准患者其中男 例 女 例 年 龄 岁 平 均 年 龄(.)岁肿瘤位于额叶 例顶叶 例岛叶 例丘脑 例 定义瘤旁组织为 对比增强序列明显强化部位或动态增强高灌注部位周围 内但未见影像学异常的区域正常脑白质定义为 外的白质区域 例提供肿瘤样本 例提供肿瘤边界 例提供正常脑白质 所有样本性质均为病理学专家判定结果肿瘤样本按照 中枢神经系统肿瘤分类均为高级别胶质瘤其中 级 例均为胶质母细胞瘤 野生型 级 例包括少突胶质细胞瘤 突变伴/联合缺失型 例星形细胞瘤 突变型 例 纳入标准:()神志清楚有基本沟通能力()术前能够配合进行颅脑 且制作术中计划()术后病理根据 中枢神经系统肿瘤分类证实高级别胶质瘤()患者或家属同意本研究并签署知情同意书 排除标准:()患其他恶性肿瘤的()患有活动性肝病、严重肝肾功能不全充血性心力衰竭呼吸功能衰竭等严重基础疾病的()样本自离体状态至开始光学检测时间超过()光学检测时受到其他光源意外干扰.方法.样本采集所有患者术前均在本中心行颅脑 平扫 增强检查部分病例行 动态增强扫描 手术前制定手术计划手术过程中术者结合神经导航实时定位使用取瘤镊取样 肿瘤组织取自增强核磁最明显强化或动态增强高灌注处由于部分患者 对比增强序列明显强化部位和动态增强高灌注部位相差较大该类情况在强化部位和高灌注部位分别取样瘤旁组织取自影像学的肿瘤边界外 内部分肿瘤位于功能区的病例为避免出现神经功能损伤未采集该类组织正常脑白质取自术中造瘘过程中接近大脑皮层且距肿瘤边界 外的白质区域但术中无需造瘘的浅部肿瘤考虑伦理要求未采集此类样本 取样后将样本浸泡至盛有磷酸盐缓冲液()的试管内并将试管置于冰盒中并在离体 内送往实验室进行光学检测以确保光学检测时组织样品接近于在体状态.光学检测光学检测前使用 冲洗清除组织样品表面血液减小血液对光谱的干扰 待检样本放置在操作平台光学探头与样本轻轻接触激发光波长为 开启激发光源后输出的光束通过激发光纤后照射在待检样本表面产生的荧光经收集光纤后进入光谱仪光谱仪输出的信号在计算机以原始数据形式展示并以.形式保存 每个样本至少随机选取 个采集点共 例样本选取 例采集点 为了尽可能减少环境光对采集到的光学光谱的影响光谱采集过程全程在黑暗环境下进行(图)采集结束后将样本浸泡在福尔马林溶液中固定石蜡包埋切片后使用 染色后经病理学专家判读样本性质.数据分析 采用 绘制光谱并提取相关数据数据均使用 .统计学软件进行分析 根据自发荧光峰分布特点本研究选取 波段进行分析比较不同组织样本的荧光峰值后对光谱进行基线归一、峰拟合等处理后提取各样本荧光峰面积、荧光峰半高全宽()以及荧光峰波长相关数据通过方差分析及多重比较评估不同组织的光谱特征是否存在差异以 .认为差异具有显著意义 对具有显著差异的指标绘制 曲线进行二分类判断 类样本中两两鉴别的敏感度与特异性临床神经外科杂志 年第 卷第 期图 实验流程 结 果本研究采用 激发光作为激发光源 据以往研究表示在该波长激发光作用下内源性荧光团 和脂质的荧光峰分别位于 和 左右卟啉通常由于不同的存在形式表现出 个荧光峰基本形式(卟啉峰)和中性形式(卟啉峰)分别位于 和 左右 根据组织内内源性荧光团发射光的最大强度进行方差分析(表)可见四个荧光峰值均存在统计学差异(.)多重比较提示 类样本可根据脂质峰与卟啉峰 最大强度两两区分(.)但在 峰与卟啉峰 中瘤旁组织与正常脑白质并无显著差异表 人体组织内源性荧光团的激发波长、发射峰波长自发荧光团激发光波长()荧光峰值波长()脂质卟啉(基本形式)卟啉(中性形式)表 利用内源性荧光团荧光峰值进行方差分析肿瘤 瘤旁 白质 总计 值 峰.脂质峰.卟啉峰 .卟啉峰 .注:表示 类样本在该峰最大强度上存在显著差异(.)进一步进行多重比较 以具有显著差异的指标绘制 曲线判断荧光波峰最大强度区别三者的灵敏性与特异度结果提示荧光强度可以很好得区分肿瘤组织和瘤旁组织、肿瘤组织与正常脑白质但作为瘤旁与白质鉴别指标效果不佳特异性仅有.(图)因此本研究进一步对平滑后的光谱进行基线归一化、峰拟合等处理提取各个荧光峰的峰下面积、及发射峰波长相关数据进行统计学分析将单个样本的多个采集点光谱进行光谱平均每个样本获得 条光谱肿瘤组织 个采集点共 例样本瘤旁组织 个采集点共 例样本正常脑白质 个采集点共 个样本 方差分析提示 组样本在、脂质、卟啉荧光峰下面积、脂质荧光峰发射波长及卟荧光峰半高宽存在显著差异(.)多重比较提示肿瘤组织与瘤旁组织相比在 种荧光团峰下面积均有显著差异与正常脑白质相比在脂质、卟啉峰下面积存在显著差异这与以荧光强度进行方差分析结果大致相同(表)同时肿瘤与瘤旁、肿瘤与白质在卟啉 也可以明显区分而瘤旁组织相较于白质在脂质荧光发射光波长表现了更明显的蓝移(表)以具有显著差异的指标绘制 曲线计算 类样本二分类的灵敏性与特异度结果提示肿瘤与其他两类组织鉴别指标保持一致使用脂质峰面积与卟啉峰 面积作为鉴别指标时肿瘤组织与瘤旁组织区分度最高(灵敏度.特异性.)肿瘤组织与正常白质可利用脂质峰面积、卟啉峰 面积、卟啉峰 面积及 .明显区分(灵敏度.特异性.)脂质荧光发射波长偏移可能是鉴别瘤旁组织与正常脑白质的关键因素(灵敏度.特异性.)见图、图:取样位置术中导航图:组织病理切片(染色):荧光光谱图 不同取样位置的影像学、病理学及荧光波峰对比表 肿瘤组织、瘤旁组织及正常脑白质多重比较两两比较 值 峰肿瘤 瘤旁.肿瘤 白质.瘤旁 白质.脂质峰肿瘤 瘤旁.肿瘤 白质.瘤旁 白质.卟啉峰 肿瘤 瘤旁.肿瘤 白质.瘤旁 白质.卟啉峰 肿瘤 瘤旁.肿瘤 白质.瘤旁 白质.注:表示二者存在显著差异(.)方差分析前进行方差齐性检验 种检验指标方差齐性检验显著性均 .使用韦尔奇修正值分析多重比较使用塔姆黑尼分析 讨 论胶质瘤是中枢神经系统最常见、人体恶性度最高的肿瘤之一男性可能因为激素影响及遗传特征常较女性患病率高这与本研究患者组成一致其中 为高级别胶质瘤(级 级)常有弥漫浸润性生长边界不清等特点因此手术全切困难复发率高 但是手术切除仍然是治疗的首要手段大量研究证实高级别胶质瘤的手术切除率与预后密切相关 术中核磁、术中导航、术中超声等技术极大提高了神经外科医生的胶质瘤全切率与手术精确度降低了对患者不必要的损伤但是这些术中辅助技术仍然有许多不足如术中核磁技术的安装及维护费用、术中复杂的操作流程术中导航技术由于操作者的经验可能会导致不准确的注册由于手术的进行 表 利用荧光团波峰相关数据的方差分析及多重比较肿瘤 瘤旁 白质 值峰下面积.波长.脂质峰下面积.波长.卟啉 峰下面积.波长.卟啉 峰下面积.波长.指方差齐性检验显著性 .者多重比较使用 分析 同列标有不同字母者表示组间差异显著(.)临床神经外科杂志 年第 卷第 期:肿瘤与瘤旁灵敏度.特异性.:肿瘤与白质灵敏度.特异性.:瘤旁与白质灵敏度.特异性.图 类样本二分类 曲线图 类样本二分类 曲线(展示 .曲线)及脱水药物的使用可能会导致导航漂移术中超声技术的精确度仍有待定论 因此本研究旨在发展一种术中实时识别高级别胶质瘤边界的新技术希望能够辅助神经外科医生判断肿瘤切除区域 既往研究通过检测分析自发荧光光谱实现了对肺肿瘤组织及边界、食管和恶性食管癌及髓内常见肿瘤的区分 该技术在胶质瘤鉴别方面也取得了良好的结果 等通过构建胶质母细胞瘤大鼠模型并利用自发荧光光谱特征对肿瘤及正常脑组织进行了鉴别 等利用内源性荧光团荧光寿命的差异区分开了人体高级别胶质瘤与低级别胶质瘤 等通过对荧光光谱的分析成功对星形细胞瘤、胶质瘤、脑膜瘤和神经鞘瘤进行了分类 本研究认为自发荧光光谱具备识别高级别胶质瘤边界的潜力同时要避免激发光术中对正常组织造成损伤 紫外光是波长为 辐射的短波光不能引起人们的视觉它是频率比蓝紫光高的不可见光 长期暴露在紫外光内会引起光毒反应 而选取波长过大的激发光会导致部分荧光团的光谱受到干扰因此本研究选择了 的激发光进行体外研究自发荧光光谱特性严格依赖于结合或游离条件()和 都存在于细胞质中仅有还原态的()和氧化态的 才表现出荧光特性它们的数量和氧化还原状态与它们参与能量代谢和信号转导密切相关 本研究中提示肿瘤组织中 荧光峰存在下降的表现这与之前的研究结果相符 这可能是瓦尔堡效应的作用之所以肿瘤生长速度较快是因为肿瘤细胞与正常细胞获取能量的方式不同在这一现象中正常细胞通过氧化磷酸化直接将葡萄糖代谢为丙酮酸 然而肿瘤细胞倾向于使用另一种途径通过有氧糖酵解来产生能量 有氧糖酵解循环将 转化为 导致 生成减少 因此肿瘤的有氧糖酵解可能是降低肿瘤细胞 荧光强度的主要因素 另外肿瘤内血管增生和辅酶 与假体基团蛋白质的结合被认为是导致该峰蓝移的原因 荧光发射峰的内源性荧光团主要是脂质在肿瘤组织中观察到这个峰的强度明显下降肿瘤组织中的脂质过氧化可能是这一现象的原因脑组织中氧化还原的稳态是由酶和非酶抗氧化防御系统共同调节的 其中最相关的内源性抗氧化系统包括谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白酶、过氧化物歧化酶和过氧化氢酶胶质瘤会破坏这一稳态引起过度的氧化应激导致脂质过氧化 本研究中瘤旁组织较正常白质的脂质峰发射波长明显蓝移这 .可能与脂褐素有关脂褐素存在于细胞质中由吞噬作用和自噬过程剩余的未消化物质组成在生理条件下以胞浆内颗粒的形式积累 恶性肿瘤细胞比正常细胞生长和分裂更快因此脂褐素仅在正常脑细胞中积累而在肿瘤细胞内含量极低作为肿瘤浸润区的瘤旁组织中也有少量存在 后的荧光峰归于原卟啉的作用其中原卟啉的基本形式在 左右有一个荧光峰而受光照后氧化的卟啉环被氧化后形成氯环在 左右有另一个荧光峰 在本研究中相较于瘤旁与白质肿瘤组织的 个卟啉峰强度与峰下面积均下降这是由于细胞外基质的降解肿瘤组织不具有完整的细胞结构促进肿瘤组织中卟啉与其他物质相互作用的增加以致卟啉水平下降 近些年对内源性卟啉及其衍生物尤为关注氨基乙酰丙酸()导致卟啉聚集已经被大量证据证实在神经外科中荧光素引导下的手术是一种重要的术中可视化技术手术前为患者注射或口服 这种荧光前药物由于血脑屏障破坏可导致原卟啉在肿瘤组织中特异性代谢当其被蓝紫光照射时肿瘤内的原卟啉会发出红色的荧光 术中通过装载光学滤光片的显微镜利用荧光团发出的荧光识别肿瘤的边界这极大提高了高级别胶质瘤的手术切除率 但是该技术主要依靠外源性荧光剂随着手术时间的推移正常脑组织随着荧光素的外泄也会出现类似肿瘤区域的荧光显影这会影响手术医生的判断 内源性荧光团无需标记但不如外源性荧光剂直观在临床应用前还需要大量样本的总结以确定更精确的计算方法值得注意的是组织荧光不仅与内源性荧光团的浓度相关而且还受检测组织对光的吸收和散射特性影响 另外内源性荧光团对其存在形式和微环境的变化高度敏感如氧化还原反应和酸碱度这都是值得继续研究的问题 此外本研究发现能够明显区分正常脑白质与瘤旁组织的指标有限这可能与高级别胶质瘤浸润性生长的特点有关有研究证明其浸润区能够达到增强核磁边界外 处 因此即使本实验中正常脑白质的病理切片均未发现肿瘤细胞但其可能已经受到肿瘤浸润区微环境或理化性质的影响 幸运的是本研究最终发现了脂质荧光峰波长或许是区分二者的关键因素这仍然需要大样本的研究进行验证本研究结果显示肿瘤组织与瘤旁组织及正常组织的自发荧光光谱存在差异表明自发荧光检测技术未来有望应用于高级别胶质瘤边界识别 为了真正评估这种自发荧光光谱检测技术的临床价值还需进一步的在体研究利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突参考 文 献 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