食品检验技术在微生物学方面的应用终稿.doc

食品检验技术在微生物学方面的应用吕美娜（黑龙江省轻工科学研究院，哈尔滨，150001）摘要：近年来，随着分子生物学和微电子技术的飞速发展，快速、准确、特异检验微生物的新技术、新方法不断涌现，微生物检验技术由培养水平向分子水平迈进，并向仪器化、自动化、标准化方向发展，提高了食品微生物检验工作的高效性，准确性和可靠性。本文将近几年来食品卫生微生物检验技术的研究进展进行了详细介绍。关键词：食品检验技术 微生物学 食品安全 PCR技术 我国是食品消费和贸易大国。近年来，发达国家越来越多地以安全、卫生、健康和防止疫情传入为由，打着保护人类与动植物生命健康、维护工农业生产安全的旗号，设置技术性贸易壁垒，制定的检疫要求数量越来越多，我国出口食品产品遭到拒绝时常发生。随着分子生物学技术的不断发展，新的微生物检验技术和方法被广泛的研究和应用。近年来，经过国内外学者不断努力，以创建不少快速、简便、特异、敏感、低耗和使用的微生物检验技术和方法。尤其是利用分子生物学技1，以核酸生物化学为基础的聚合酶链反应、核酸探针、生物芯片等技术和方法尤为突出。本文就相关分子生物学技术在微生物检2中的最新应用研究进展进行综述。1.食品检验技术概述所谓快速检测方法3，首要的是能缩短检测时间，以及在样品制备、实验准备、操作过程和自动化上简化的方法，体现为下面3个方面；一是实验准备过程简化，使用的试剂较少；二是样品经简单前处理后即可进行测试，或采用高效快速的样品处理方式；三是简单、快速和准确的分析方法，能对处理好的样品在很短时间内测试出结果。从广义上来讲，能将原有的检测方法时间缩短的都可以称为快速检测方法。但从严格意义上讲，快速检测方法和常规方法相比，除应具有准确性外，还应具有明显的简洁性、经济性与便捷性。2.食品检验技术2.1 PCR技术PCR（Polymerasc Chanin Rcaction)是多聚酶链式反应的简称，PCR技术4是由 Klcppc 等人在1971年首先提出的。该方法通过对人工难以培养的微生物相应DNA 片段的扩增。检测扩增产物含量，从而快速地对食品中致病菌含量进行检测。检测时，首先在高温下(95）使得蛋白质变性。DNA双链变成单链；再迅速降温（55），每条DNA单链退火。这就是所谓的热循环。之后温度重新上升到95。开始新的循环。经一套扩增循环（21到31次）将1个单分子DNA扩增到107分子。整个过程可以在1h内通过自动热量循环器完成。理论上，只要样品中含有一份子沙门氏菌的DNA，通过PCR技术完全可以在短时间内检测到。这种测定方法的优点是测定结果迅速、灵敏度个特异性高、检测成本低；但其存在的最大问题在于PCR产品的污染。PCR技术采用DNA扩增和自动化程序对特定的致病菌进行检测，已经成功地对沙门氏菌、大肠杆菌、产单核细胞李斯特菌等致病菌进行了有效测定。实时定量技术是近年来发展起来的新技术，这种方法既保持了PCR技术灵敏、快速的特点，又克服了以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点。另外，还有重复性好、省力、低费用等优点。实时定量PCR技术是从传统PCR技术发展而来，其基本原理相同，但定量技术原理不同。实时定量技术应用了荧光染料和探针来保证扩增的特异性，并且荧光信号的强弱同扩增产物成正比，从而准确定量。该技术在基因突变的检测、基因表达的研究、微生物的检测5、转基因食品的检测等领域均有重要的应用价值。2.2 微量生化法20世纪40年代后期首先开创了微生物生化法的纪元。随着人们对细菌进行快速生化特性的需求增加，使高精密度（90）和高重现性的商业试剂盒得以快速发展。至今，市售的微生物鉴定用试剂盒有多种，常见的有MICRO-ID、API等。 API由20个含干燥培养基的微管组成6，其中的培养基用于进行酶促反应或糖发酵试验。检验时将预处理的菌悬液加入微管中培养后观察颜色变化并记录，输入APILAB Plus 软件得出结果。API创建了独特的数值鉴定法，可鉴定15个系列、600多个细菌种。因此具有简单、快速、可靠等特点。2.3 快速酶触反应及代谢产物的检测快速酶触反应是根据细菌在生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，根据酶的特性，选用相应的底物和指示剂，反应的测定结果有助于细菌快速诊断。如美国3MPetfifilm TM微生物测试片可分别快速测定细菌总数、霉菌、酵母菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠菌群等。2.4 生物芯片技术生物芯片技术是20 世纪90 年代中期以来影响深远的科技进展之一，是融合了微电子学、生物学、物理学、化学和计算机科学等为一体的高度交叉的尖端新技术。生物芯片7根据反应体系状态的不同，可分为固相芯片和液相芯片，根据检测对象的不同又可分为基因芯片和蛋白芯片。液相芯片较传统的固相芯片相比主要优点在于：检测准确度高，信息质量稳定，检测结果可重复性好，检测用时短以及操作简便.因此液相芯片在生命科学研究的诸多领域，比如病原菌感染的检测方面，有着广阔的应用前景，现在液相芯片技术已广泛应用于基因检测、细胞因子检测、蛋白质分析和药物检测等。基因芯片因其可快速、准确、高效的地显示病原体的遗传信息，已广泛的应用于基因序列的分析、病原微生物感染8的快速诊断、病原菌变异及耐药机制的研究，以及基因分型、分子流行病学调查和抗感染药物的研制等。基因芯片技术的兴起也给微生物检测带来了新的革命，近年来已有此技术应用于大肠埃希菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌检测的报道。3.食品检验在微生物学中的主要作用 食品检验在微生物学中的主要作用归纳起来有如下方面：（1）预测产品的货架期和安全性。（2）将食品中有关微生物的选择试验准确地局限于较小范围，大大减少了产品开发的时间和资金耗费。4食品中的微生物预测 微生物预测技术中信息库的建立，需要考虑许多与食品安全和质量相关的栅栏因子。虽然在一个简单的预测模型中不能包括所有的栅栏因子9，2一般预测型包括温度、PH、Aw（盐或保湿剂）、防腐剂等几种主要栅栏因子及其相互作用。加工者可根据计算机数据库提供的栅栏，预测未来成型产品的可贮性以及可能生长繁殖的微生物。在食品设计中，栅栏因子的合理组合既能确定食品的微生物稳定性，又能改进产品的感官质量和营养特性，提高经济效益。在食品设计步入计算机化的进程中可将现有的理化、微生物数据收集起来，建立一个带有数据库的计算机软件，通过计算机来提出配方、工艺流程和包装方式的合理化建议，至少在理论上使该产品的微生物稳定性得到保证。此外还可应用计算机软件来改进不稳定产品。4.1 预测微生物学研究方法预测微生物学的研究方法有2个：(1)研究在不同条件下微生物生长情况。这些数据用于确定迟滞期或生长参数，于是这些数据通过三维响应面建立模型10，给出2种(或以上）环境参数同时作用时细菌比生长率的变化或不生长的条件。大多数模型应用Gompertz函数和综合响应面分析方法，预测致病菌的生长或毒素产生的概率，以及在不同食品配方、贮藏参数下（温度、pH、NaCl、气体成分等）的关于迟滞期、比生长率、最大细菌浓度等信息。这些模型可以有效地确定防止致病菌生长或食品腐败所需的栅栏因子。（2）研究在真实的配送环境中，随着环境因素如温度、湿度的改变，食品可能出现的情况。如利用恒定环境条件中得出的数据，评估环境条件改变时微生物的生长和货架期的损失。这方面的研究还很少，但很可能是今后预测微生物学发展的方向。5总结分子生物学技术在微生物检验应用中的发展趋势主要体现在以下三个方面：一是朝着高度特异性、高度灵敏性和高度自动化的方向发展；二是会进一步与其它学科技术交叉融合，打破各技术之间的局限，从而将检验的范围扩展；三是新的分子生物学技术还将会不断的产生，其在微生物检验中的应用也将越加广泛。食品检验技术的建设，应根据“从农田到餐桌”实施全程控制的要求，积极追踪国际先进的食品安全科技发展动态，针对影响我国食品安全的主要因素确定关键技术领域，逐步深入地开展食品安全基础研究，优先发展食源性危害危险性评估技术，进一步发展更加可靠、快速、便携、精确的食品安全检测技术，加快发展食品中主要污染物残留控制技术，发展食品生产、加工、储藏、包装与运输过程中安全性控制技术，尽快建立起适应全面建设小康社会需要的食品安全科技体系。参考文献：1王永卫,张利峰,张鹤晓.常用检测技术及其在检验检疫领域中的应用J.检验检疫科学.2003年,13(5):5153. 2 王敏，检验食品微生物新方法J.四川食品与发酵 中外食品.2005年，15（4）：1031073闫雪,姚卫蓉,钱和.国内外食品微生物快速检测技术应用进展 食品科学.2009年，23(3):2326.4李平,PCR技术及其在食品微生物检测中的应用 食品科学.2010年，12（7）：98102.5吴奇志,韦东芳,张鹏等. 金黄色葡萄球菌伴蜡样芽孢杆菌食物中毒的实验诊断 浙江预防医学.2004年，18（2）：7782.6张洁梅.食品微生物检验技术的研究进展.现代食品科技J. 2005年,21(2):221223.7Yasuhara T,Yuuki T, KagamiN.Novel quantitative method for detection of pectinatus using rRNA targeted fluorescent probes J.J Am Soc Brew Chem,2001,59(3): 117121.8Livingston AD, Campbell CJ, Wagner EK etal.Biochip sensors for the rapid and sensitive detection viral diseaseJ.Genome Biol, 2005,6(6) :112115.9 Hanschild A H W， Hilsheimer R.Jarvis Getal.J.2003,9(5):8892.10Harper R,Dymock D,Booth V et al.Detection of unculturable Bacteriain periodontal health and diseaseby PCRJ.JClinMicrobiol,1999,37(5):14691473.