菌株对三种有机磷农药降解效率的研究.doc

优选菌株对三种有机磷农药降解效率的研究

作者：余云涛 宋泱 王 凯 指导老师 曾国寿

摘要 从被农药污染的土壤采集样品，在不同农药浓度下富集耐农药的微生物。对菌株进行分离与筛选、耐农药能力的测定、菌落计数，优选了耐药能力较高的A、B、C、E、F、G六个菌株，并对菌株进行了微生物学鉴定。研究了这六个菌株的降解有机磷农药情况，结果表明：菌株C对辛硫磷的耐受性较强，但A和E对辛硫磷的降解率较高，48hr后的降解率达到了65.6%和76.1%；菌株B、C对甲基异柳磷的耐受能力较强，但菌株E、F和A对甲基异柳磷的降解活性较强，48hr后的降解率分别为77.5%、74.5%和63.8菌株E对.水胺硫磷的降解活性最高，48hr后降解率高达91.2%。采用A，E，F混合菌株接种培养48hr，对辛硫磷，甲基异柳磷，水胺硫磷的降解率分别为82.3%，84.7%，93.5%。
6个菌株的对硫磷水解酶基因PCR结果表明，菌株A、C、F、G四株芽孢杆菌能扩增出预期的900bp条带。细菌破碎液对有机磷农药的降解及其pH值的实验结果表明，E菌株内含有降解有机磷的酶，不属于已被克隆的对硫磷水解酶，它的基因序列至今未见报道；建议改为：E菌株内含有降解有机磷的酶，但未能扩增出对硫磷水解酶的900bp条带，所以它可能由其他的酶参与有机磷的降解。B菌株耐受性很强，其B菌株内不含对硫磷水解酶改为但同样未能扩增出900bp的条带。E的较适pH为7.2，A、B、F的较适pH为8.0。
关键词 优选菌株 有机磷农药 降解效率

引言
有资料表明我国每年有机磷农药的使用量约为8万吨。它们的广泛使用是造成环境污染和食品污染并威胁人类生存与可持续发展的主要原因之一，并成为发达国家贸易绿色壁垒的重要手段[1]。在土壤和水体中，微生物对有机磷农药的降解起着重要的作用[2~4]。因此，驯化和分离具有高效降解有机磷农药的微生物，并探讨农药污染的生物修复的可能性，消除农药污染，净化环境具有重要的现实意义。

1 材料和方法
1.1 细菌的富集 从厦门后坑菜园地分别采集施用过辛硫磷、多菌灵和敌敌畏的土样三份。分别取1g土样加入100 mL含有10 ppm、50 ppm、100 ppm辛硫磷乳剂的LB培养基（牛肉膏3 g，蛋白胨10 g ，NaCl 5 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0~7.2）中，28℃震荡培养48 hr，以富集耐受或分解辛硫磷的细菌。
1.2细菌的分离与筛选 上述富集后的培养物以倾注法分离单菌落。分离后的细菌分别接种到含100 ppm、200 ppm和500 ppm的辛硫磷、甲基异柳磷和水胺硫磷LB平板上，28℃恒温箱中培养3天后，观察细菌的生长情况，选择耐受谱广、耐药性强、生长旺盛的菌株。进一步考察验证采用含上述不同浓度的不同农药的LB斜面培养基，28℃培养3天。
1.3耐药能力的测定
上述筛选后得到的菌株，进一步考察了它们在不同农药浓度下的生长情况。在含有100 ppm、200 ppm、500 ppm、1000 ppm、1500 ppm的甲基异柳磷、辛硫磷乳剂、水胺硫磷的液体LB中加入1 mL菌悬液，28℃震荡培养48 hr后，以蒸馏水为空白，以无接菌的含不同浓度的不同农药的LB液体培养基为对照，测定OD600。
1.4菌落计数实验
用5mL无菌水洗下菌苔，取1 mL菌悬液加入9 mL含有浓度为100 ppm、200 ppm、500 ppm、1000 ppm辛硫磷的液体LB培养基中，摇均后放在28℃摇床中培养3天后，稀释10-6、10-7倍，分别取稀释液0.1 mL至培养皿中，倒入温的固体LB培养基摇匀，在28℃恒温箱中培养3天后，观察各平板中菌落的生长情况，记录菌落数量、大小、颜色和形态，得出各个细菌的耐受浓度范围。
1.5菌株的鉴定
1.5.1菌落形态观察 在LB平板上划线，培养后观察菌落形态。
1.5.2 革兰氏染色和镜检 经革兰氏染色后，以枯草芽孢杆菌和大肠杆菌为对照，油镜观察。
1.5.3 BioLog MicroLog3自动微生物鉴定系统鉴定：
⑴将活化后的细菌接种于LB平板，产芽孢菌株需进行十字划线培养。
⑵30℃培养18hr后，以无菌棉签将不产芽孢菌株菌落从平板上轻轻抹下，悬浮于预加19 mL GN/GP-IF（0.4.% NaCl、0.03%聚醚 F-68、 0.02% Gellan Gum）接种液的Turbidity Standard（BioLog公司）浊度管中, 在Turbidimeter 浊度计 （BioLog公司）上测定比浊为20%T；以无菌竹签将产芽孢菌株菌苔轻轻刮下，注意选取接种十字外侧菌苔，将挑下菌苔涂布于干的Turbidity Standard浊度管内壁，并将其尽量涂布成膜状，加入19 mL GN/GP-IF接种液，测定比浊为28%T。
⑶将接种液接种于MicroPlate GP2 培养板 （BioLog公司）上，每孔150μL。
⑷将培养板置28℃培养4 hr及24 hr后，在MicroLog3 MicroStation Reader 读数仪 （BioLog公司）上读数，以随机GP Database数据库分析。
1.6农药降解速率的分析
将一支斜面上的菌苔用5 mL LB培养基洗下后，全部接种到45 mL含有100 ppm农药（甲基异柳磷、辛硫磷乳剂、水胺硫磷）的LB培养基中，28℃震荡培养，一定时间取样2.5 mL，测定OD600后，6000 r/min离心10min，得上清液和沉淀，清液用蒸馏水定容到25 mL，沉淀用蒸馏水悬浮后经超声波破碎，再定容到25 mL，两种样品分别经涂有100 μm/L PDMS的固相微萃取头萃取15 min，用气相色谱法[5]分析农药残留量。
1.7混合菌对农药降解率的分析
将A,E,F菌种斜面分别用5 mL LB培养基洗下后混合,按每瓶接5 mL量接入各个三角瓶中,各个三角瓶分别含有100 ppm的甲基异柳磷或辛硫磷或水胺硫磷，28℃摇床培养48 hr，按上述1.5方法分析。
1.8细菌DNA的提取
细菌过夜培养后取1.5 mL，4000 r/min离心2 min。沉淀加入567 μL的TE缓冲液，充分悬浮；加入30 μL10%的SDS和3 μL 20 mg/mL的蛋白酶K，混匀，37℃1 h；加入100μL 5 mol/L NaCl,充分混匀，再加入80 μLCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃ 10 min；加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，5000 r/min离心5 min，将上清转入一新离心管；加入等体积酚/氯仿/异戊醇，混匀，5000 r/min离心5 min，取上清于另一离心管，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，15000 r/min离心20 min，去上清，沉淀溶解于100 μL的无菌重蒸水中。
1.9 PCR扩增
引物序列[7][8]为：
引物1：5′端引物5′ＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＧＣＣＧＣＡＣＣＧＣＡＧ ＧＴＧＣＧＣＡＣＣＴＣＧ 3′
引物2：3′端引物5′ ＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＧＧＧＴ ＴＧＡＣＧＡＣＣＧ 3′
由上海生工生物工程有限公司合成。
PCR条件为：0.5 mL的离心管中加入：5μL 10XPCR缓冲液
各5μL的0.5μmol/L的引物1和引物2
5μL模板DNA
5μLdNTP（4种，每种各2 mmol/L）
1μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL）
加水至50 μL
混匀，97℃ 5 min后，92℃，30 s；60℃，30 s；72℃，3 min；35个循环；4℃。
1%琼脂糖电泳，EB染色，观察，拍照。
1.10 细菌破碎液对有机磷农药的降解及其pH值的关系
1.10.1材料
A、B、E、F四种菌（在LB液体培养基培养24 h）各50 mL
辛硫磷、甲基异硫磷、水胺硫磷（加入Tris缓冲液pH值7.2）100 ppm各100 mL
Tris缓冲液pH值7.2
1.10.2仪器
TY92-II超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司），TDL-5离心机，数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司），722智能分光光度计（厦门分析仪器厂）。
1.10.3 实验方法
取四种菌各50 mL离心1000 r/min 10 min，离心后弃沉淀留上清液。第二次离心4000 r/min 10min，离心后弃上清液留沉淀（菌泥）。将四种菌泥分别加入pH 7.2 Tris缓冲液25mL，在细胞粉碎仪粉碎。破碎后简称为A、B、E、F细胞破碎液，镜检均未见完整细胞。
细菌破碎液对有机磷农药的降解实验。将农药分组：每种农药分为灭酶、室温、40℃、50℃四组，每根试管各加入100 ppm农药2.5 mL；然后分别加入A、B、E、F细菌破碎液0.5 mL。均匀震荡、观测浑浊度后，放入水浴锅内培养45 min，之后测定各组的OD值变化，灭酶先将细菌破碎液于100℃煮沸3 min后，加入0.5 mL破碎液，置室温反应45 min。
在不同pH值下细菌降解酶作用的实验。选择四种菌降解农药的最佳温度（50℃或40℃），分为pH5.0、6.0、7.2、8.0、9.0和灭菌后pH7.2（对照）六组。每组含缓冲液2.5 mL，破碎液1 mL。在水浴锅里培养45min后测定各组OD值的变化。

2 结果与分析
2.1 细菌的富集、分离与筛选
2.1.1 细菌的富集
从厦门市后坑菜园地采集到的分别施用过辛硫磷、敌敌畏和多菌灵的土样三份，分别在10ppm、50ppm和100ppm辛硫磷浓度下富集48hr后，测定OD600值，结果表明（图1），无论是辛硫磷、敌敌畏还是多菌灵污染的土样，均有微生物的生长。在三种辛硫磷富集浓度下，微生物生长的差别较大，10ppm辛硫磷浓度下，OD值达到了0.84。
浓度ppm
OD

图1富集瓶中菌的生长情况
2.1.2 细菌分离和筛选
上述富集后的培养物经平板倾注分离，挑选菌落形态，颜色各异的16个菌落至斜面培养基。对这16个菌株，我们进一步考察了它们在100ppm、200ppm和500ppm的多菌灵、辛硫磷和甲基异柳磷浓度下的耐药情况，结合显微观察，最终选择了在各种浓度的农药中都能生长的7个菌株作进一步的研究。重新编号为A、B、C、DE、F、G。
2.2 耐药能力的测定
为进一步考察A、B、C、D、E、F、G 7个菌株的最高耐药活性，我们将这7个菌株分别接种在含100 ppm、200 ppm、500 ppm、1000 ppm、1500 ppm的甲基异柳磷、辛硫磷乳剂和多菌灵的液体LB在液体培养基中，培养2天，测定OD600值。结果表明，菌株C耐辛硫磷的能力最强，达到了1000 ppm；菌株D耐辛硫磷的能力最差，100 ppm下，OD值也仅为0.468；其它菌株在被抑制的浓度在500 ppm至1000 ppm之间（表1）。菌株B、C对甲基异柳磷的耐受能力较强，在1500 ppm下仍没有明显的被抑制，菌株D的耐受能力最弱其他菌株被抑制的浓度在200 ppm~1000 ppm之间（表2）。六种菌株对于水胺硫磷的耐受性都很强（表3）。对于不同浓度的不同农药而言，这七个菌株都能生长，只是生长速率发生明显差异。其中为100、200ppm最好，由于D号菌生长最差，留A、B、C、E、F、G 六个菌株供进一步实验。

表1不同辛硫磷浓度下的菌体生长（OD）
浓度值（ppm）
菌株
100
200
500
1000
1500
A
0.737
0.642
0.624
0.423
0.197
B
0.626
0.825
0.490
0.371
0.482
C
0.702
0.763
0.776
0.834
0.304
D
0.468
0.503
0.251
0.177
0.507
E
0.866
0.955
0.641
0.501
0.434
F
0.712
0.610
0.327
0.160
0.096
G
0.684
0.707
0.481
0.286
0.363

表2不同甲基异柳磷浓度下的菌体生长（OD）
浓度（ppm）
菌种
100
200
500
1000
1500
A
0.634
0.689
0.652
0.340
0.498
B
0561
0.808
0.818
0.847
0.719
C
0.637
0.744
0.681
0.769
0.850
D
0.419
0.472
0.505
0.573
0.649
E
0.792
0.673
0.637
0.596
0.577
F
0.685
0.624
0.675
0.379
0.671
G
0.797
0.740
0.705
0.546
0.587

表3不同水胺硫磷浓度下的菌体生长（OD）
浓度值（ppm）
菌株
100
200
500
1000
1500
A
0.089
0.052
0.222
0.351
0.485
B
0.188
0.196
0.181
0.328
0.352
C
0.048
0.075
0.134
0.098
0.313
E
0.429
0.099
0.232
0.666
1.094
F
0.099
0.266
0.289
0.302
0.921
G
0.089
0.070
0.539
0.972
0.875

2.3菌落计数结果
为了进一步考察细菌在农药存在下的生长情况，我们还通过平板计数法测定了培养液中的细菌数。通过观察和计数结果（表4），我们得出：A、E、F三种菌株对辛硫磷的耐受性有所不同。A菌在100 ppm的辛硫磷浓度下生长较好。其他浓度均生长不好；E菌耐受性较强，在不同浓度的辛硫磷浓度下生长很好，以100ppm浓度下生长最好；F菌在100ppm、200ppm、500ppm生长较好，而浓度1000ppm辛硫磷浓度下生长不好。该结果表明培养液中的细菌数变化与2.2耐药能力的测定结果基本一致。

表4 在不同辛硫磷浓度下培养液中细菌数的测定（个/mL）
菌号
100 ppm
200 ppm
500 ppm
1000 ppm
A
2.3×109
4×108
4×108
1×108
E
8.0×109
7.3×109
5.9×109
5.6×109
F
3.2×109
1.5×109
1.3×109
3×108

2.4对农药的降解
2.4.1对辛硫磷的降解
我们对分离、筛选中得到的A、B、C、E、F、G 6株对农药耐受性较强菌株，进一步分析比较了它们对辛硫磷的降解活性。结果表明（表5），菌株A和E对辛硫磷的降解活性较强。菌株E降解 24hr和48hr后，辛硫磷含量仅余38.2ppm和20.5ppm，与对照组相比，仅余对照组的35.6%和23.9%，48hr后的降解率达到了76.1%；菌株A处理24hr和48hr后，辛硫磷含量分别为53.2ppm和29.5ppm，仅为对照组的49.6%和34.4%，48hr后的降解率达到了65.6%。其它菌株与对照组相比，辛硫磷含量的差异较小，说明降解活力较低。

表5 降解不同时间后辛硫磷的残留量
培养时间（hr）
0
24
48
48hr后降解率%*
对照
118.5
107.2
85.7
0
A
—
53.2
29.5
65.6
B
—
88.1
72.9
15.0
C
—
63.1
63.0
26.5
E
—
38.2
20.5
76.1
F
—
72.0
65.3
23.8
G
—
83.9
71.2
16.9
*降解率=100%-农药残留量/对照的残留量

2.4.2对甲基异柳磷的降解
A、B、C、E、F、G 6株活性较强菌株对甲基异柳磷的降解活性，结果表明（表6），6个菌株对甲基异柳磷均有一定的降解活性，其中菌株E、F和A对甲基异柳磷的降解活性较强。菌株E处理24hr和48hr后甲基异柳磷含量分别为36.2ppm和19.4ppm，仅为对照组的39.1%和22.5%，48hr后的降解率达到了77.5%。菌株F处理24hr和48hr后甲基异柳磷含量分别为39.4ppm和22.0ppm，仅为对照组的42.5%和25.5%，48hr后的降解率为74.5%。菌株A处理24hr和48hr后甲基异柳磷含量分别为43.6ppm和31.2ppm，仅为对照组的47.1%和36.2%，48hr后的降解率为63.8%。

表6 降解不同时间后甲基异柳磷的残留量
培养时间hr
0
24
48
48hr后降解率%*
对照
101.8
92.6
86.2
0
A
—
43.6
31.2
63.8
B
—
88.6
83.5
4.1
C
—
71.4
41.7
51.6
E
—
36.2
19.4
77.5
F
—
39.4
22.0
74.5
G
—
59.4
38.8
55.0
*降解率=100%-农药残留量/对照的残留量
2.4.3对水胺硫磷的降解
根据上述结果，选择降解活性较高的A、E和F 3个菌株，进一步考察了它们对水胺硫磷的降解活性。结果表明（表7），3个菌株对水胺硫磷都有一定的降解活性，其中菌株E的降解活性最高，48hr后水胺硫磷的残留量仅余8.3ppm，只有对照组的8.8%，降解率高达91.2%。
表7 微生物降解不同时间后水胺硫磷的残留量
培养时间（hr）
0
24
48
48hr后降解率%*
对照
99.3
99.2
94.1
0
A
—
74.0
33.8
64.1
E
—
81.8
8.3
91.2
F
—
77.2
22.0
76.6
*降解率=100%-农药残留量/对照的残留量
2.5 多个菌株对多种农药的降解活性
选A、E、F 混合菌对3种农药的降解情况（见表8）；采用混合菌接种于100ppm 的不同农药中培养48hr后，农药甲基异柳磷、水胺硫磷、辛硫磷的降解速率分别为82.3%、84.7%和93.5%，说明混合菌对这三种有机磷农药有协同的作用。

表8 混合菌对三种农药的降解
农药
辛硫磷
甲基异柳磷
水胺硫磷
农药残留量（ppm）
18.3
15.0
6.3
对照组(ppm)
103.7
97.8
98.1
降解率%*
82.3
84.7
93.5
*降解率=100%-农药残留量/对照的残留量
2.6菌株的鉴定
经革兰氏染色后油镜观察，以上6株细菌均为革兰氏阳性菌株（图2）。其形态总结于表9。
B
C
A
E

F
G
图2革兰氏染色

表9 受试菌株形态总结
菌株编号
菌落形态
细胞形态
产孢后形态
A
白色
杆状
锤头状
B
白色
杆状
—
C
白色
梭状
锤头状
E
粉红色/红色
球状
—
F
白色
杆状
锤头状
G
白色
杆状
锤头状
综合革兰氏染色、显微观察和BioLog自动微生物鉴定系统鉴定的结果，以上6株细菌鉴定如下（表10）：

表10 受试菌株鉴定结果
菌株编号
革兰氏染色
芽孢
自动鉴定结果
(属)
中文属名
备注（种名）
A
+
有
Bacillus sp.
芽孢杆菌属
疑为
Bacillus sphaericus
球形芽孢杆菌
B
+
无
Brevibacterium sp.
短杆菌属
疑为
Brevibacterium epidermidis
表皮短杆菌
C
+
有
Bacillus sp.
芽孢杆菌属
疑为
Bacillus sphaericus
球形芽孢杆菌
E
+
无
Micrococcus sp.
微球菌属
疑为
Micrococcus luteus
滕黄微球菌
F
+
有
Bacillus sp.
芽孢杆菌属
—
G
+
有
Bacillus sp.
芽孢杆菌属
疑为
Bacillus sphaericus
球形芽孢杆菌
2.7 对硫磷水解酶基因的PCR扩增
为检验我们获得的6株具有较高有机磷农药水解活性的菌株是否含有有机磷水解酶基因，我们参考文献8的方法，对6株细菌进行了PCR扩增。
PCR扩增的结果见图3，从图中可以看出，菌株A、C、F和G均扩增出了预期的900bp的条带（箭头所指）。当然，该扩增条带是否就是对硫磷水解酶基因还有待进一步的确认。

图3 对硫磷水解酶基因的PCR扩增结果
A、B、C、E、F、G为菌株号，箭头所指为900bp的扩增带

2.8 细菌破碎液对有机磷农药的降解及其pH值的关系
2.8.1细菌破碎液对有机磷农药的降解
三种农药加入四种菌株细胞破碎液，均匀震荡，甲基异柳磷与四种菌的细胞破碎液混合液较浊，而辛硫磷和水胺硫磷混合液透明。（从表11看，应该是辛硫磷较混浊，因为他的OD值较高！）
从表11可以看出：A对辛硫磷、甲基异柳磷有水解作用，其降解最适温度为50℃，对水胺硫磷较倾向于耐受。B倾向于耐受而不是水解。E对三种农药都有降解作用，从最适pH实验看，其降解酶的特性不同于A、B、F。F对甲基异柳磷水解较适40℃，对水胺硫磷、辛硫磷耐受。

表11 四种菌株的降解酶对三种农药降解后（45min）OD值的测定
辛硫磷
灭酶CK
室温
40℃
50℃
A
0.688
0.611
0.579
0.574
B
0.784
0.777
0.738
0.75
E
0.754
0.923
0.829
0.578
F
0.697
0.69
0.658
0.662
甲基异柳磷
灭酶CK
室温
40℃
50℃
A
0.318
0.222
0.197
0.183
B
0.399
0.367
0.368
0.364
E
0.371
0.532
0.403
0.172
F
0.356
0.273
0.248
0.254
水胺硫磷
灭酶CK
室温
40℃
50℃
A
0.195
0.168
0.156
0.162
B
0.388
0.362
0.344
0.348
E
0.352
0.502
0.361
0.159
F
0.327
0.25
0.227
0.268

2.8.2 不同pH值下细菌降解酶作用的实验。（删除“。”）
从表12看出，E的较适pH为7.2，A、B、F的较适pH为8.0

表12 在不同pH值下四种降解酶降解农药的效果（1-OD值的变化）建议改为用OD表示
菌号
pH5.0
pH6.0
pH7.2
pH8.0
pH9.0
pH7.2底物温育45'后加1.0mL酶（已灭活）
A（50℃）
0.594
0.655
0.657
0.707
0.682
0.656
B（50℃）
0.379
0.393
0.381
0.421
0.391
0.396
E（50℃）
0.597
0.556
0.624
0.618
0.584
0.325
F（40℃）
0.470
0476
0.467
0.527
0.493
0.427

图5：在不同pH值下四种降解农药酶降解效果（1-OD值的变化）建议改为用OD表示

3讨论
3.1 优选菌株的有效途径的探讨
要获得降解农药的生物，首选是细菌，因为自然界中存在大量的分解能力不同的细菌，正是这些细菌的作用，我们的地球才能得到净化，垃圾才不会堆积如山。然而在分离降解农药的细菌中有两条思路，一条是在LB培养基中分离细菌，然后才令其与不同农药作用，从中得到在一定农药中可生长的细菌。显然，这是一种大海捞针的做法；采用高浓度胁迫条件下筛选降解利用农药的菌株的方法，抑制大量细菌的生长，应该算是一个好的思路。
随着工作的深入开展，发现在不同浓度不同农药下能生存的细菌不一定就是能降解农药的细菌，说明在能生长的菌株中，仍然存在大量的抗农药或耐受农药的细菌。所以经过胁迫条件下的富集培养，再经过平板分离，斜面筛选，液体培养筛选，是一种较好、较便捷的途径。
3.2 关于农药胁迫下细菌的生长与农药残留分析方法的探讨
由于有机磷农药为水不溶物质，当它们与培养基混合时，势必出现混浊，给细菌生长的分析设下了难题，以OD值测定菌的生长，实际上是农药被降解后混浊度减少和细菌生长的综合结果，所以在分析过程中OD值随时间的延长而上升表示细菌生长旺盛。OD值也有可能呈平衡或下降的状态，只能表明细菌生长速率较慢，而不能认为细菌不生长，因为这些实验细菌是经富集初筛、斜面复筛后得到的，它们都能较好地生长，本实验用细菌计数法计数也证明这一点。由于培养过程中出现浑浊，在农药残留量分析方面，单单考虑离心上清液的残留量是不正确的，因此，我们认为只有把离心沉淀物（菌体加农药的聚集物）中的残留量都考虑进去才是准确的。
3.3 关于菌株对三种有机磷农药降解效率的探讨
我们分离得到的6个菌株对有机磷农药均一定的降解活性，其中菌株E、F、A的降解活性最强，48hr处理后，菌株E对辛硫磷、甲基异柳磷和水胺硫磷的降解率分别高达76.1%、77.5%和91.2%，菌株A也分别高达65.6%、63.8%和64.1% 。该降解活性高于赵金辉[6]等人报道的动性球菌的降解活性。F菌株虽然对辛硫磷降解活性较低，但对甲基异柳磷和水胺硫磷均有较高的降解活性，48hr后分别高达74.5%和76.6%。利用这3个菌株对辛硫磷、甲基异柳磷和水胺硫磷的混合处理，其效率分别达到82.3%、84.7%、93.5%。表明三个菌株混合菌对三种农药降解有明显的协同作用。证明这3个菌株均具有较好的应用前景，采用混合菌株来降解有机磷是一种有效途径。
3.4 关于菌株的鉴定
菌株的鉴定结果表明，菌株A和F为芽孢杆菌属（Bacillus spp.）的细菌，该属细菌广布全球，是普遍存在于土壤和水土系统中的一种产芽孢菌，其中有的具杀虫性能。而且该属细菌也是比较常见的有机磷农药降解菌，研究得也比较深入[1]。菌株E为微球菌属（Micrococcus sp.）的细菌，该属细菌也是革兰氏阳性球菌，广泛存在于土壤、水及人类的皮肤和呼吸道，但鲜见该属细菌具有降解有机磷农药的报道。
我们的结果还说明，菌株C对辛硫磷、甲基异柳磷和多菌灵均具有较好的耐受性，但其对辛硫磷和甲基异柳磷的降解活性并不高，表明农药耐受性好的菌株，其降解农药的活力并不一定就高，两者之间没有绝对的相关性，所以这类菌株对农药的耐受机理值得关注。
3.5关于对硫磷水解酶基因的PCR扩增
PCR扩增是一种用于检测某种基因存在与否的简便方法。我们利用已知的对硫磷水解酶基因的序列，设计引物，对我们获得的6株有机磷降解菌进行PCR扩增，以检测是否有对硫磷水解酶基因的存在。结果表明A、C、F、G菌株能扩增出预期的900bp的条带。这4个菌株正好都属于芽孢杆菌属，这是否与芽孢杆菌具有较强的有机磷降解活性[9]有关，还有待进一步的研究。
3.6 关于三种菌株对有机磷农药降解机理的探讨
有机磷农药的降解涉及到磷酸酶，自然界中存在着碱性和酸性碱酸酶两大类，从三个混合菌株的协同作用情况看，这三种菌所存在磷酸酶的种类应该是不尽相同的。
本项目分别进行二项实验研究：一是对硫磷水解酶基因的PCR扩增，结果表明A、C、F、G含有对硫磷水解酶基因，B、E菌株没有此基因。据有关资料显示，对硫磷水解酶液在pH 7-9之间保持较高的稳定性，pH为8时酶的稳定性最好[10] ，说明其酶属于碱性酶。二是为了进一步探究菌株降解的机理，做了“四种菌株降解酶对三种有机磷农药的降解及其pH的关系”的实验，实验结果表明：①E菌株虽然不含对流磷水解酶基因，但对三种有机磷农药具有明显的降解效率，说明E菌株内含有降解有机磷的酶，这种酶应该不属于已被克隆的对硫磷水解酶，它的基因序列至今未见报道，有待我们进一步探研讨。②B菌株与A、F菌株较适应在pH值8条件下生长发育，对三种有机磷农药耐受性很强，但降解效率不明显，也说明其B菌株内不含对硫磷水解酶，有关耐农药机制有待进一步探讨。本项实验采用细胞破碎，并在不同温度下研究菌株降解酶的效率，是一种有效手段。

参考文献：
1. 石成春 郭养浩 刘用凯，环境微生物降解有机磷农药研究进展，上海环境科学，2003，22（12）：863-867
2. 潘学东 虞云龙 李少南等，一硫代磷酸酯类杀虫剂的微生物降解，农药学学报，2001，3（2）：73-76
3. 曹志方 王银善，甲胺磷农药的微生物降解，环境科学进展，1996，4（6）：32-35
4. 虞云龙 宋凤鸣 郑重等，一株广谱农药降解菌（Alca ligenes sp.）的分离与鉴定，浙江农业大学学报，1997，23（2）111-115
5. 王若苹，固相微萃取——毛细管气相色谱法快速同步分析水中有机氯及有机磷农药，中国环境监测，2004，20（3）：23-27
6. 赵金辉 罗启芳 李霞等，水胺硫磷降解优势菌的筛选及其降解条件的研究，重庆环境科学，17（2）：27-30
7. F.奥斯伯 R.布伦特 R.E.金斯顿等，颜子颖 王海林译，精编分子生物学指南，北京：科学出版社，1998
8. 傅国平 崔中利 徐玮等，甲基对硫磷水解酶的重组表达及其纯化和性质研究，微生物学报，2004，44（3）356－360
9. 仪美芹,王开运,姜兴印等，微生物降解农药的研究进展，山东农业大学学报(自然科学版),2002,33(4):519～524
10. 刘智，马爱之，张晓舟，张小华，李顺鹏 甲基对硫磷水解酶酶促反应体系建立及特性研究 南京农业大学学报2003，26（4）：60-63

致谢：厦门大学生命科学学院宋思扬老师指导本实验工作并协助细菌的鉴定，厦门市环境监测中心站王若苹老师协助农药含量的测定，特此致谢。