酵母表面展示技术.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,酵母表面展示技术,细胞表面是细胞内外的功能界面。一些表面蛋白横穿过质膜，另一些以共价或非共价结构与细胞表面复合物结合一起。细胞能够锚定特定的表面蛋白，并且能将其限制在细胞表面的特定区域。在生物技术中，细胞表面通常用于研究蛋白跨膜的机理。酵母细胞表面展示技术是近年来发展较快的一种真核蛋白表达系统，其基本原理是将外源靶蛋白基因,(,外源蛋白,),与特定的载体基因序列融合后导入酵母细胞，利用酵母细胞内蛋白转运到膜表面的机制使靶蛋白固定化表达在酵母细胞表面，在医药、食品、生物燃料等多个工业领域都有广泛的应用前景。原理,酵母是单细胞真核生物,根据交配型的差异分为两种单倍体:MAT和MATa,其细胞表面分别表达-凝集素和a-凝集素,它们可以介导细胞之间的交配融合。酵母表面展示系统应用的是酿酒酵母的a-凝集素,外源蛋白借助它在细胞表面得到展示。a-凝集素由核心亚单位(Aga1)和结合亚单位(Aga2)两部分组成,Aga1共有725个氨基酸,它与酵母细胞壁的-葡聚糖共价连接。Aga2共有69个氨基酸,它通过两个二硫键与Aga1结合,表达于酵母细胞表面。Aga2的N端部分参与二硫键的形成,外源蛋白通过与Aga2的C端融合可展示于酵母细胞表面。,酵母表面展示系统基本组成,宿主细胞,酿酒酵母一直被认为是安全的模式生物（GRAS）而广泛应用于食品工业和医药工业，也是目前常见的用于酵母表面展示的宿主细胞。除酿酒酵母外，近年来酵母展示平台已被拓展至某些能利用甲醇作为单一碳源和能量来源的细胞株，如巴斯德毕赤酵母、汉逊酵母。与酿酒酵母相比，嗜甲醇酵母细胞株具有更优越的发酵特性，如能够在廉价的碳源中生长和更高的细胞培养密度，这些特性使其在需要大规模发酵的应用中更具优势，例如展示异源酶作为全细胞催化剂。另外，毕赤酵母对外源蛋白的 O-糖基化程度更高，因而对展示的外源酶具有更好的稳定效果。,载体蛋白,酵母细胞表面包被着一层坚硬的细胞壁，由内层的葡聚糖骨架和外层的甘露糖蛋白构成。甘露糖蛋白主要包括两类蛋白质：一种以非共价方式松散地结合于细胞壁，可以用SDS 抽提；另一类蛋白必需以-1,3 或-1,6 葡聚糖酶消化细胞壁后才能抽提，这类蛋白常含有 GPI 锚定区域。-凝集素和絮凝素以及细胞壁蛋白如Cwp1p，Cwp2p，Tip1p 等都属于 GPI 家族蛋白，外源蛋白与它们融合后可被共价锚定于细胞表面，这些蛋白是常用的酵母表面展示载体蛋白。,外源蛋白,酵母表面展示系统适合展示各种真核蛋白，包括酶、细胞识别因子、受体、抗体、抗原等，被广泛地应用于蛋白质工程、全细胞催化、生物转化、细胞吸附、分子识别、生物治疗、信号转导、生物传感器和疫苗等领域。外源蛋白与载体蛋白的融合方式有 C 末端融合、N 末端融合、插入融合。对某些外源蛋白，选择恰当的融合方式可以明显改善展示效果或蛋白的功能特性，如 Aga2p 蛋白有良好的柔性，外源蛋白可以以 N 末端或 C 末端两种方式与其融合。研究表明抗 CD3单链抗体融合于Aga2p 蛋白C末端时，其亲和力较天然蛋白降低 30100倍5，而融合于N末端时活性得以恢复。,酵母表面展示系统的类型,最常见的酵母表面展示表达系统包括,:,凝集素展示表达和絮凝素展示表达,凝集素展示表达系统,是将外源基因与酵母编码凝集素,C,端编码序列,(,含,GPI,锚定信号序列,),连接后插入质粒载体的信号肽下游，融合蛋白诱导表达后，信号肽引导嵌合蛋白向细胞外分泌，由于融合蛋白,C,末端存在含,GPI,锚定信号的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵母细胞壁中，从而将蛋白分子展示表达在酵母细胞表面。,絮凝素展示表达系统,利用絮凝素基因与外源蛋白融合，并将融合蛋白展露表达在细胞表面，此系统又包括两个子系统:GPI锚定系统和絮凝结构域锚定系统。GPI锚定系统是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源蛋白，此系统与凝集素展示相似;絮凝结构域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能结构域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识别酵母细胞壁中的甘露聚糖链并以非共价作用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物,酵母表面展示系统的应用,酵母表面展示与酒精发酵,传统的酒精发酵是以淀粉质谷物或糖蜜为原料。随着燃料酒精需求的日益增长，以天然纤维素类资源生产酒精的研究也日益受到人们重视。由于纤维素类物质是自然界中一种潜在的可再生资源，对解决未来能源问题有着巨大的潜力，因此，天然纤维素酒精发酵具有重要意义。Fujita 等成功地将三种纤维素水解酶同时展示在酿酒酵母表面，从而构建了能够增效和按顺序降解纤维素的全细胞生物催化剂。,酵母表面展示系统与新药筛选,将未知功能的目的基因产物或特定病理过程相关蛋白产物展示在酵母表面，对cDNA 表达文库或突变体库进行筛选，能发现与这些未知功能的基因产物或病理过程相关产物发生相互作用的物质，有助于对未知基因功能的研究，并能发现一些药物作用的新靶点，或筛选到治疗疾病的新药先导化合物。Visintin 等将酵母表面展示技术与酵母双杂交技术相结合，将抗体的单链（scFv）片断连接到转录因子VP16 的激活结构域(AD)上，将抗原连接到酵母LexA的结合结构域(DB)上，以His3 和LacZ 为报告基因，建立抗原抗体相互作用的展示方法。当抗原-抗体发生相互作用时，AD 和DB 的结合将启动报告基因的表达，可通过营养缺陷培养基进行检测。这种方法从scFv 突变体展示库中将有可能筛选到抗原特异的抗体，为疫苗及抗体类药物的研制提供良好的平台。,酵母细胞表面展示与生物吸附,环境污染物的生物修复是以酶促降解或生物吸附为基础的，例如微生物对重金属的吸附就包括两种途径,:(1),与细胞表面复合物结合，,(2),逐渐吸收在细胞内进行消化。然而通过胞内消化降解有毒物质必须使细胞内酶，蛋白质或污染物跨越细胞膜这一屏障，比较缓慢及效率低而且不可重复利用。利用表面展示技术能较好地解决这一问题，吸附蛋白直接展示在细胞表面，不仅使吸附过程快捷高效还可以利用回复剂如,EDTA,对其进行处理使之不断重复利用。,酵母表面展示与酶技术,酶的固定化是指借助物理或者化学方法将酶固定于特殊的相，使得酶与整体流体分开，但是仍然能够进行底物和效应物分子交换并发挥其催化效能的一种技术。与游离酶相比，固定化酶提高了酶的稳定性，并使酶能够反复回收利用。但是，传统的固定化方法也会产生一些不利因素，例如由于增加固定化操作，导致酶固定化过程中的活性收率损失；另外由于固定化操作需用载体，因而增加了载体成本费和固定化操作费用。利用表面展示技术将具有催化活性的酶展示于酵母等微生物细胞表面就形成了全细胞催化剂，与传统的细胞内酶和外分泌酶不同，表面展示的酶以共价或非共价方式固定于细胞外表面，这种独特的空间定位使其相对自由酶而言有许多优良的特性，如温度、有机溶剂稳定性、可多次重复使用等，这些特点与传统的固定化酶技术相似，但无需额外的蛋白纯化和固定的操作，有着良好的应用前景。,