仔猪粪便中乳酸菌的分离, 鉴定及其抑菌特性的研究.doc

仔猪粪便中乳酸菌的分离、鉴定及其抑菌特性的研究
张素辉, 曹国文, 徐登峰, 王孝友, 蒋安
（重庆市畜牧科学院 荣昌 402460）

摘要 从健康仔猪新鲜粪便中分离到3株乳酸菌，对其进行了属和种的生化鉴定，结果为，菌株La与Lt均为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），Ls为乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis）。对分离的三株乳酸菌的代谢产物进行了体外抑菌试验研究，结果表明，3株菌乳酸菌代谢产物对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌都有较明显的抑制作用；对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，沙门氏菌次之，对大肠杆菌的抑菌效果相对较弱。
关键词: 乳酸菌；分离鉴定；抑菌特性

Isolation-identification and bacteriostasis-bacteriostasis of lactobacillus from piglet′s diachorema
Zhang suhui, Cao Guowen, Qiu Jinjie, Xu Dengfeng, Wang Xiaoyou, Jiang-an
（ChongQing Academy of Animal Sciences ChongQing RongChang）
Abstract Isolated 3 strains lactobacillus from piglet's fresh feces and identified its genus and strain,, results are: the Ls strain is Lactobacillus lactis, the La and Lt strains are Lactobacillus acidophilus. And carried the metabolic product of three strains in the study of inhibition activity. These experiments proved that, all the Lactobacillus’ metabolite had apparent inhibition to Colibacillus, Salmonella and Staphylococcus aureus, had the most Bacteriostasis result to Staphylococcus aureus, Salmonella was next to, and the effect with Colibacillus was more feeble.
Key words lactobacillus；isolation and identification ；inhibition-activity

仔猪腹泻，是引起起仔猪生长受阻和死亡的重要原因之一，一直是困扰养猪业发展的难题。据资料统计，我国仔猪死亡率一般波动在15-25 %之间，2周龄以内死亡率为26%，2-4周龄的死亡率为16%，断奶前后因腹泻而导致的死亡占总死亡率的49.11%[1]。以前常采用在断奶仔猪饲粮中添加抗生素的办法来控制腹泻，但抗生素在抑制致病性微生物的同时，也破坏了动物体内微生物菌群的平衡，增加了消化道疾病的发生。同时病原体的耐药性问题越来越严重，部分抗菌药物在畜产品中的残留等对人类健康构成极大威胁。研究和开发无毒、无副和无残留的生物药品已成为热点课题，近年来，微生态制剂越来越受到众多人士的青睐，微生态调节剂是根据微生态学原理，调整微生态平衡的制剂。微生态疗法是根据微生态学原理，用微生态制剂扶持和恢复肠道菌群的平衡以达到预防腹泻的目的。1998年AAFCO年鉴公布了43种可用作益生素的菌种，其中半数以上是乳酸菌(Lactic acid baciteria)[2]。乳酸菌在益生菌制剂的研究和生产中扮演着重要的角色。本研究的目的是从健康仔猪的新鲜粪便中分离出在体外具有广谱抑菌杀菌效果的乳酸杆菌菌株，从而为开发应用于防治仔猪腹泻疾性病的微生态制剂提供理论依据和菌种保证。
作者简介：张素辉（1980-），女，研究实习员。从事动物微生态制剂与新兽药的研究。
1 材料与方法

1.1 材料
1.1.1 样品
健康乳猪新鲜粪便，采自多个规模化养猪场。
1.1.2 培养基
增菌及分离培养基：改良MRS培养基。
微量生化鉴定管：购自杭州微生物试剂有限公司。
1.2 方法
1.2.1菌株的分离
在改良MRS液体培养基中加入适量的新鲜乳猪粪便，富集培养24小时后，用接种环取培养液划线接种于改良MRS琼脂平皿，37℃有氧培养48-72h，挑取形态及颜色各异的菌落分别划线接种作纯培养，并进行镜检观察分离细菌的染色及形态特征。
1.2.2分离菌的鉴定
挑取平板上纯培养的革兰氏阳性无芽胞杆菌：作硝酸盐还原试验，明胶液化试验，过氧化氢酶试验，靛基质试验和硫化氢试验；作七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇和蔗糖发酵试验。
1.2.3乳酸菌对常见肠道致病菌的抑菌试验
乳酸菌新鲜培养液，按2%(v/v)接种于MRS液体培养基中，静置培养18-24h,取适量培养液，5000rpm,离心30min，吸取上清液备用。
临床分离保存的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌经活化后，接种于普通肉汤中培养12h，用灭菌吸管分别吸取各菌液培养物0.5ml于普通营养平皿中，用L棒均匀涂布，待琼脂表面水分干燥后，在平板表面放置灭菌的牛津杯，取制备的乳酸菌上清液于牛津杯内测定其对常见肠道病原菌（大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌）的抑菌活性，置37℃培养10 h，观察并测定抑菌圈的大小。同时设立相应代谢产物pH值相同的MRS液体培养基作对照。
判定标准为：抑菌圈直径4 mm 判定为不敏感；抑菌圈5-10 mm 判定为低度敏感 抑菌圈直径11-15 mm判定为中度敏感；抑菌圈直径大于15mm判定为高度敏感[3]。
2 结果
2.1本试验分离得到3株乳酸菌，编号分别为La、Ls、Lt，其菌落特征、菌体形态及染色特征见表1。

表1 乳酸菌菌落特征、菌体形态及革兰氏染色结果
Table1 Characteristics of colonies and results of G’staining cells of lactic acid bacteria
菌株Strains
菌落特征
Characteristics of colonies
革兰氏染色
G’staining
菌体形态
Morphology of bacteia
La
微白色，露滴大小，圆形,微凸，表面粗糙，边缘不整齐
G+
两端钝圆，中等大，无芽孢杆菌；MRS固体培养基上培养物呈散在排列；MRS肉汤培养物呈单个散在排列
Ls
微白色，露滴样大小，圆形,隆起，表面光滑，边缘不整齐
G+
两端钝圆，无芽孢小杆菌；MRS固体培养基上培养物呈散在或短链状排列；MRS肉汤培养物成短链状排列
Lt
微白色，露滴大小，圆形,隆起，表面粗糙，边缘不整齐
G+
两端钝圆，中等大，无芽孢杆菌；MRS固体培养基上培养物呈散在排列；MRS肉汤培养物呈单个散在排列
2.2各菌株的鉴定
根据革兰氏染色镜检可知，La、Ls、Lt菌为革兰氏阳性的无芽孢杆菌。生化实验表明，它们均不能利用硝酸盐，过氧化氢酶试验和靛基质试验阴性，不液化明胶，不产生硫化氢。依据这些菌株糖发酵试验的结果（见表2），参见《伯杰细菌鉴定手册》（第八版）[4]，最终鉴定为：菌株La为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），菌株Ls为乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis），菌株Lt为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。
表2 乳酸杆菌属种的碳水化合物反应
Table2 Carbohydrate-reaction of species in cillobacterium
菌株
七叶苷
纤维二糖
麦芽糖
甘露醇
水杨苷
山梨醇
蔗糖
La
－
－
＋
－
＋
－
＋
Ls
＋
＋
＋
－
＋
－
－
Lt
＋
＋
＋
±
＋
－
＋
注：“＋”表示90%或90%以上的菌株为阳性反应；“－”表示大多数菌株（90%或以上）为阴性反应；“±”表示有些菌株为阴性，其他菌株为阳性。
Note: “＋”demonstrates 90% or more than 90% strains which are positive reaction; “－”demonstrates strains which are negative reaction; “±”demonstrates some of strains are positive reactions,the other are negative reaction.
2.3乳酸菌代谢产物对常见肠道致病菌的抑菌试验结果
由表3可以看出，3株菌乳酸菌代谢产物对3株病原指示菌都有较强的抑制作用，所有菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径在18-23mm之间，各菌株抑菌圈直径由大到小依次为Ls、Lt、La；对沙门氏菌的抑制效果相对较低，抑菌圈直径在14-17mm之间，各菌株抑菌圈直径由大到小依次为Ls、La和Lt；对大肠杆菌抑菌圈在15-19mm之间，各菌株抑菌圈直径由大到小依次为Ls、La和Lt。
比较La、Ls、Lt菌株对沙门氏菌抑菌效果发现，Ls菌株代谢产物的抑制效果最明显，其抑菌圈直径极显著大于La、Lt菌株（p<0.01）；La菌株对沙门氏菌的抑制作用高于Lt菌株，差异显著（p<0.05）。La、Ls、Lt菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌效果均存在极显著差异（p<0.01）。
表3 不同乳酸菌菌株代谢产物对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径（单位:mm）
Table3. The bacteriostasis-diameter of the metabolic product of three strains to the Salmonella, Colibacillus, Staphylococcus aureus (unit, mm)

沙门氏菌
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
La
14.6±0.1Aa
16.6±0.3A
18.3±0.3A
Ls
16.5±0.2B
18.5±0.2B
22.6±0.2B
Lt
14.2±0.2Ab
15.8±0.1C
21.5±0.5C
注：表中的抑菌圈直径以平均值±标准差表示。肩标字母不同者表示差异显著，大写字母代表p<0.01，小写字母代表p<0.05，无标记或字母相同者表示差异不显著P>0.05。
Note: The bacteriostasis-diameter in the table was denote by “average value ± tandard deviation”. The shoulder noted by different letter expressing notable difference, majuscule represent (p<0.01)，minuscule represent p<0.05), no signs or identical letter indicate the difference is not quiet (P>0.05).
3 讨论
目前，许多报道显示，微生态制剂不但能提高机体的生长性能[5]，而且能降低肠杆菌科细菌在胃肠道各部位定植水平而影响肠道菌群的微生态平衡[6]，专业人士越来越多地注意到饲喂乳酸菌微生态制剂能够影响肠道菌群的微生态平衡，Van Schie（1987）[7]认为乳酸杆菌的乳酸和挥发性脂肪酸在降低肠杆菌科细菌如沙门氏菌在肠道定植具有重要作用。乳酸菌在培养过程中可以产生有机酸(如挥发性脂肪酸、乳酸、丁酸、醋酸等)、双乙酰、过氧化氢、细菌素等化合物及大量的乳酸杆菌和低pH环境，这四个要素均能独自地或共同地作用于胃肠道菌群，这些混合物的分子量、生物化学性质、抑菌范围各不相同。
人们对乳酸菌益生素的研究热点集中在采用新方法分离或开发新的益生素菌种上。陈世琼[8]认为，从菌种的安全性以及对宿主肠道的粘附性考虑，益生素菌种最好采用分离自宿主肠道优势菌中的优良菌种；另外，为节约生产和技术成本，应从宿主体内分离耐氧的菌种。当然也可使用改造后仍然安全的菌种，但需做毒理学实验验证其安全性。本研究采用改良MRS培养基，其中含有高浓度的乙酸盐离子，低pH值5.4，并有刺激因子吐温-80，可抑制其它许多微生物的生长，起到选择培养的作用，因而能从粪便这样的复杂区系中选择培养出乳酸菌。在整个培养过程中均采取有氧培养，分离出的乳酸菌为兼性厌氧菌，为今后的研究和生产减去了较为复杂的厌氧培养条件。
乳酸杆菌的代谢产物通过影响有害菌的定植黏附及抑制其生长而达到保护机体的作用[9]，这些代谢产物可以是低分子量或者高分子复合物，后者被认为是质粒编码的蛋白质，即细菌素，目前已经有许多关于乳酸杆菌细菌素的报道[10，11]。本实验在筛选出1株乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis），2株嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）的基础上，通过牛津杯平板扩散实验对所分离到的乳酸菌菌株进行体外抑菌试验，发现所分离的3株乳酸菌发酵上清液有较强的抑菌活性，而相同pH值条件下的MRS培养基液在相同条件下没有抑菌活性，从而排除了酸的作用。这与田召芳(2003)[12]的结果相一致，说明乳酸菌代谢产物中可能含有细菌素等其它抑菌物质的存在。
实验室及临床实验研究表明，乳酸菌对肠道细菌如大肠埃希菌、沙门菌等引起的肠道感染有拮抗作用[13]，本实验分离乳酸菌的抑菌试验也证实了这一论点，尤其是对致病性大肠埃希菌有抑菌活性，可以作为益生素制备用菌株，该研究为开发应用该分离乳酸菌提供了理论依据和菌种保证。

参考文献：
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【7】Prohaszka. L,B. M. Jayarao, A. Fabian,etal. The role of intestinal volatile fatty acids in the Salmonella shedding of pigs, Zentbl. Vetmed. Reihe B,1990,37:570–574.
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