利用啤酒和味精废水开发微生物发酵培养基及其应用研究.doc

利用啤酒和味精废水开发微生物发酵培养基及其应用研究

学院：生命科学学院
年级： 2008级
专业：食品科学与工程
指导老师：杨小兰
姓名：赵立
学号： 2008314038

摘要：利用啤酒和味精废水.经稀释添加某些成分后，成功研制出微生物发酵培养基。比较研究了真菌、细菌和链霉菌(生物农药生产菌)利用食品工业废水发酵培养基的可能性。结果表明，井冈霉素菌和阿维菌素菌不能利用废水培养基，分离、保存的特异灰色链霉菌西藏变种TAS-1和代号为HX-0501乳黄色细菌能利用废水发醉培养基。经生物测试，其发酵代谢产物对多种病原真菌具有很高的拮抗作用。该研究为利用食品工业废水生产生物农药微生物处理废水及废物再生利用找到了一条新的途经。
关键词:食品工业废水 发酵培养基 微生物 生物农药
1概述
我国是世界第一大啤酒和味精生产国：2005年产啤酒3189/104t，每生产It啤酒平均排出约15m，废水，目前每年生产啤酒产生的废水在47835/104t以上。目前我国味精产量约130x104t。每年生产味精排出的废水达3250xl04t左右。啤酒发酵废水中主要污染因子是化学需氧量、生化需氧量和悬浮物，其浓度含量为化学需氧量1000一2500mg/L生化需氧量1500mg/L、悬浮物300-600mg/L、TN30-70mg/L(不同厂家浓度不同),pH值为4.5-7.0(显微酸性)。味精废水中化学需氧量含量高达(4-8)*10000mg/L、生化需氧量(2-3)*10000mg/L、悬浮物为(l-2)*10000mg/L、菌体1.0%-15%、总氮约1.0%。味精废水中有机物含量较高，有大量的氨态氮和硫酸根等，pH约3.0-3.4，是高浓度酸性有机废水。生产啤酒和味精的原料主要是谷物类粉、蛋白质、氨基酸等，其产生的废中含有大量的淀粉、植物蛋白和氨基酸等营养物质。这些废水如不能得到很好处理就直接排放，将对生态环境造成严重污染，同时也浪费了大量资源。TAS-l是从西藏高原土壤中分离到的l株特异灰色链霉菌，其活体和代谢产物对多种病原真菌具有极强的拮抗作用;AA、CL菌是稗草生防潜力菌禾长蠕抱菌改良的优异特性的供体菌，同时也是开发真菌蛋白农药的原始菌种
以啤酒、味精发酵废水为主要成分，添加少量其他元素研制成发酵培养基，一些特异的真菌、细菌和链霉菌能有效利用这些发酵培养基进行发酵培养，产生菌丝团或发酵代谢产物。TAS-1和HX-0501发酵原液及稀释10倍、50倍后，对多种病原真菌具有很好的研制效果。过去废水处理主要依靠机械、物理及化学的方法。近年来，随着科学技术的进步，一些经济、高效、生态、可再生利用的生物处理废水的技术得到开发并逐步应用到实际中去。在味精废水生物处理中，主要是利用味精废水研制发酵培养基发酵培养苏云金芽抱杆菌(B.t)生产生物农药。在利用废水培养微生物进而处理废水方面国内已有一些研究报道，有人在利用啤酒废水养殖螺旋藻、培养单细胞蛋白(SCP)方面作过尝试;在利用味精废水培养微生物方面主要集中在培养、驯化苏云金芽抱杆菌B.t菌株，达到既处理废水又生产生物农药的目的。
本研究试图利用啤酒、味精工业废水作为主要成分研制微生物发酵培养基发酵培养真菌、细菌和链霉菌。达到既处理废水又能利用废物、培养目标菌生产生物农药的目的。
2材料和方法
2.1材料
2.1.1发酵菌种灰色链霉菌西藏变种、交链抱菌、弯抱菌。HX-0501(乳黄色细菌，未鉴定)、井冈霉素菌、阿维菌素菌。
2.1.2供测病原菌稻瘟病菌、纹枯病菌、稻叶鞘腐败病菌、稻恶苗病菌、兰花炭疽病菌等。井冈霉素菌、阿维菌素菌分别由浙江桐庐汇丰生物化工有限公司和浙江升华拜克生物股份有限公司提供外，其他菌种均为本研究室分离保存。
2.1.3培养基质啤酒废水培养基、味精废水培养基、马铃薯蔗糖(葡萄糖)培养基(PD)。
2.2方法2.
2.1废水培养基的制备
2.2.1.1 PD发酵培养基:按200g去皮马铃薯在1000mL水中煮沸后再煮15一20min，加人189蔗糖或葡萄糖即可。
2.2.1.2 啤酒废水培养基:按啤酒废水与水体积比为1:4.5-5.5进行稀释，调节值至6.5-7.2，葡萄糖或蔗糖1.0%-2.0%g/mL)、尿素1.0%-2.0%(g/mL)、，以及常用和常规量的无机盐、微量元素。
2.2.1.3 味精废水培养基:按味精废水与水体积比为l:4-6进行稀释，调节pH值至6.5-7.2，葡萄糖或蔗糖1.5%一2.0%(g/mL)、淀粉2.0%一3.0%(g/mL)、，以及常用和常规量的无机盐，添加量为0.1%-0.15%(g/mL)、微量元素维生素C、,添加量为0.03%-0.05%(g/mL)。
2.2.2 保存在冰箱中的上述各菌种移人PDA平板培养基上培养5一6d备用。啤酒、味精废水培养基分别取200mL装人500mL三角瓶中，用“妙洁”牌PE保鲜锡膜封口，在121℃、0.15MPa高温高压下灭菌30min，取出冷却备用。
2.2.3 真菌、细菌、放线菌利用废水培养基试验发酵菌种AA菌、CL菌、HX一0501菌、TAS-1菌、井冈霉素菌和阿维菌素菌各取直径7mm的菌块5块，分别接人上述灭菌培养基中，以不接菌的培养基为空白对照。封口锡膜用接种针打7个小孔以利通气。
2.2.4接种后的三角瓶置空气恒温摇床，在(28土0.5)℃、125-130r/min振荡发培养7d，观察发酵液浊度、利用情况、真菌菌丝团大小，测定菌丝团质量。
2.2.5发酵滤液生物测定TAS-1和HX-0501菌在啤酒、味精废水及PD发酵培养基中的发酵液在13000r/min高速离心15min，滤出上清液备用。原液对峙培养测定将7mm直径灭菌吸水滤纸浸吸发酵原液放人PDA培养基平板，距吸水滤纸15mm处接种7mm直径被测菌块，置28℃恒温培养，在3d和7d(纹枯菌在3d和7d)测量菌落直径。将发酵滤液加人PDA培养基稀释配成一定浓度的发酵液一PDA培养基。测定对稻瘟病菌、纹枯病菌、叶鞘腐败病菌、恶病菌、兰花炭疽病菌等的抑菌效果。取上清液与PDA培养基混合，配成稀释10、50、100倍的上清液一PDA培养基，倒入直径为90mm灭菌培养皿中，制成不同浓度发酵上清液一PDA平板，以不加发酵液的PDA为对照。将直径7mm的供测病原真菌菌块接入上述平板中央，置28℃恒温培养，在3d、7d(纹枯病菌在3d、7d)测定菌落直径，计算抑菌率。
3结果与分析
3.1废水发酵培养基利用试验测定了AA、CL(真菌)，井冈霉素菌、阿维菌素菌、TAS-l(链霉菌)和HX-0501(细菌)对废水发酵培养基的利用。结果表明，AA和CL菌能很好的利用啤酒、味精废水为主要基质的培养基，发酵培养后产生大量的菌丝团(球)，菌丝团黄褐色一黑色、直径大小不等。CL菌在3种废水酵培养基中生长情况好于AA菌。培养液由发酵前的浑浊状，变成浅黄至金黄色清澈的液体，对废水起到净化作用。TAS-1和HX-0501也能利用3种废水培养基进行发酵培养。HX-0501菌在啤酒、味精废水培养基中形成大量浑浊状细菌，颜色由乳黄色到浅黄色。TAS-1在上述3种废水培养基中发酵，产生大量细小的放线菌球，菌球乳黄色一浅黄色，发酵液浅黄至金黄色(见表l)。

但井冈霉素菌和阿维菌素菌不能利用啤酒、味精废水培养基进行发酵培养。
3.2 TAS-l和HX-0501发酵滤液的生物测定
3.2.1原液对峙测定先用发酵滤液原液采用对峙培养法测定对水稻稻瘟病菌、纹枯病菌、恶苗病菌、叶鞘腐败病菌，兰花炭疽病菌和叶斑病菌的拮抗作用。TAS一l在啤酒、味精培养基中发酵原液对稻瘟、纹枯、炭疽和叶斑病菌的拮抗作用较强，抑制率均在80%以上、对恶苗和鞘腐病菌稍差，抑制率在63%-77%。
TAS-1在PD培养基中发酵原液对炭疽病菌抑制率在80%以上外，对其他5个病原菌抑制率均在80%以下。HX-0501在4种发酵培养基中发酵原液对稻瘟病菌的抑制率超过80%，在啤酒、味精培养基中发酵原液对水稻纹枯、叶鞘腐败病菌，兰花炭疽和叶斑抑制率在75%-82%，对恶苗病菌较差，抑制率为
68.8%-73.8%。HX-0501在PD培养基中发酵原液除对稻瘟菌抑制率为81.2%外，对其他5个病原菌抑制率在67.5%-70.5% (见图1、2，图中: 1、啤酒废水发酵葡萄酒，2、味精废水发酵培养基，3、PD发酵培养基)。

3.2.2发酵原液稀释测定将TAS-l和HX-0501在啤酒、味精和PD培养基中的发酵原液分别稀释10、50、100倍，测定了对稻瘟病菌强致病力菌株中AI和中Bl、恶苗病菌和纹枯病菌的抑菌效果。TAS-1在啤酒、味精中的发酵原液稀释10、50倍时，培养7d(纹枯菌5d)对稻瘟菌、恶苗菌和纹枯菌的抑制率在59.8%-822%，在PD中的发酵液抑菌效果比啤酒、味精中的稍差。TAS-1在3种培养基中的发酵原液稀释100倍后对供试的所有菌抑菌率菌明显下降。Hx-0501在啤酒、味精、PD培养基中发酵原液稀释10倍对稻瘟菌、纹枯菌和恶苗菌拮抗较强，稀释50倍后效果有所下降，稀释100倍后抑菌效果下降明显。HX-0501对纹枯菌的拮抗作用强于TAS-1，结果见表2、3。

3 结论
本研究利用啤酒、味精废水为主要原料，成功研制出发酵培养基。试验证明我们分离、保存的AA、CL真菌，TAS-1放线菌和HX-0501细菌均能在上述工农业发酵废水培养基中发酵培养，TAS-l和HX-0501发酵培养后可产生代谢产物。生物测试结果表明，TAS-1和HX-0501代谢产物对水稻多个病原真菌和兰花病原菌具有较好的防治效果。现正优化废水培养基发酵培养TAS-1和HX-0501的工艺参数，以获得两菌的高发酵效价。利用废水研制发酵培养基，培养特定微生物生产生物农药目前正申请国家发明专利。是否可利用食品工业废水大规模生产食用菌菌种也值得进一步研究。随着生活水平的提高，人们对自身健康、粮食、食品及环境安全等越来越重视，要求改善生产、生活环境的呼声越来越高。党和政府高度重视环境保护，已将其作为基本国策。利用生化方法和微生物技术相结合处理工业生产中产生的废水，一方面达到净化、处理废水的目的;另一方面可充分利用废水中的有机营养物质生产生物蛋白、絮凝剂、生物农药等。这种变废为宝、废物循环再生利用，具有经济、社会和生态效益同步的效果。这类方法和技术必将得到进一步的重视和发展，应用前景十分广阔。
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