中草药多糖的分离提取和理化性质研究.doc

题目：中草药多糖的分离提取和理化性质研究
姓名：***
学院：生命科学学院
学号：20110*****
年级：2011级

中草药的分离提取和理化性质研究

生命科学学院 2011级 *** 201101****

摘 要：本实验采用热水浸提和乙醇醇沉的方法提取刺五加多糖，得到的粗多糖回收率为1.21﹪，再对得到的粗多糖进行定性、定量分析。用苯酚—硫酸法测定已提取出的粗多糖中单寡糖与多糖的含量为14.7%；经过薄层层析分析单糖的组成，其中组成多糖的单糖多属于葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖；用Sepharsose CL—6B柱层析法测定多糖的相对分子量约为3.47万道尔顿。高效液相色谱分析单糖含的结果是刺五加多糖中的单糖种类有半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖等，其中含量较多的葡萄糖和甘露糖。
关键词：刺五加 多糖 分离提取 理化性质

多糖是由单糖连接而成的多聚物，人们对多糖的研究已经有很长时间的历史，对多糖的初始研究可追溯到1936年Shear对多糖抗肿瘤活性的发现，至20世纪50年代，陆续发现一些真菌多糖和高等植物多糖具有明显的抑瘤活性。最近又发现许多中药多糖还具有降血糖作用。70年代以来，科学家们发现多糖及糖复合物在生物体内不仅是作为能量资源和构成材料，重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，广泛存在于动物、植物和微生物细胞壁中，是生物体内除核酸和蛋白质以外的又一类重要的生物分子。科学研究已经确认糖类物质具有许多生物活性，包括抗肿瘤、免疫、降血糖和抗病毒等，而且对机体几乎无毒副作用。中药多糖因具有增强机体免疫功能及抗肿瘤降血糖等药理作用，而且几乎没有毒性与副作用，因此引起国内外药理学家、生物学家和化学家们的关注。
多糖的提取应根据多糖的来源和提取部位的不同确定所用提取方法。多糖的提取方法主要有水提法、酸提法、碱提法、超声提取法和微波提取法等。本次试验的材料为刺五加，采用水提法提取刺五加多糖，利用苯酚一硫酸比色法间对多糖含量进行测定，并依次利用薄层层析法、高效液相色谱法以及分子筛层析对刺五加多糖的理化性质进行分析。

1 材料与方法
1.1 实验材料
刺五加
1.2 实验试剂
浓硫酸、葡萄糖、6%苯酚、标准样（木糖、半乳糖醛酸、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和阿拉伯糖）、三氟乙酸（TFA）、展开剂（正丁醇：乙酸：水=4：1：5）、显色剂（苯胺—邻苯二甲酸正丁醇饱和水溶液）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、氢氧化钠（NaOH）、浓盐酸（HCl）、磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）、磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、无水乙醇（CH3CH2OH）、无水甲醇（CH3OH）、氯仿（CH3Cl）、超纯水、蓝色葡聚糖，重铬酸钾及相对分子量为15.3万，46.1万的葡聚糖标准品、生理盐水等。
1.3实验仪器
可见分光光度计、分析天平、离心机、SHIMADZU LC-10AT（岛津） 液相色谱仪、 SHIMADZU LC（岛津）色谱柱、层析缸、硅胶板（10 × 10 cm）、毛细管、喷雾器、烘箱、水解小瓶、蒸发皿、吹风机、层析柱 1.5 cm ×100 cm、恒流泵、自动部分收集器、紫外检测仪、记录仪 、可见光分光光度计、容量瓶、移液枪、试管等。
1.4 实验方法
1.4.1 多糖的分离、提取与纯化
称取晒干的刺五加约30g，用蒸馏水浸泡约24h后，在80℃下煮提1.5h，用纱布过滤取滤液至铁钢中，再加入少量水按以上方法分别煮提1h、0.5h，将3次得到的滤液在120℃下浓缩至50ml以下，转移至两成为250ml烧杯中，加入3倍体积95%乙醇中，封上封口膜保存。醇沉后倒出上清，将沉淀3000r/min离心15min，取出沉淀，沉淀依次用无水乙醇、乙醚脱水，P2O5真空干燥过夜，即得粗多糖。
1.4.2 多糖含量测定
准确称取无水葡萄糖10 mg，加少量蒸馏水溶解，后定容至于100 mL，得葡萄糖标准液。分别准确量取标准液0（0号管）、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL于大试管中，补加蒸馏水至1.0 mL。向每只试管中加入6%苯酚0.5 mL，混匀，再加入浓硫酸2.5 mL，立即振荡，室温放置10 min，以0号管为参比，于490 nm测定光吸收值。以葡萄糖的微克数为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
准确称取多糖样品10 mg，先用少量蒸馏水溶解，然后定容至100 mL，得到多糖溶液。1号管中加入1.0 mL蒸馏水，2、3、4号管中加入1.0 mL多糖溶液。分别向每个试管中加入6%苯酚溶液0.5 mL，振荡混匀，浓硫酸2.5 mL，立即振荡。冷却10 min后，以1号管作为参比，于490 nm测定2-4号管的光吸收值。所得三个数值取平均值，根据标准曲线计算样品中的多糖含量。
1.4.3 糖组成分析
准确称取干燥的糖样5.0 mg，加入1.0 mL蒸馏水，充分溶解后转移至水解小瓶中，再加入1.0 mL 4 M TFA，120 ℃水解5 h。将水解液平均转入2个蒸发皿中（其中一份用于薄层层析法测定单糖组成，另一份份用于高效液相色谱法测定单糖组成），向蒸发皿中加入适量无水乙醇，在水浴上蒸干，除去三氟乙酸。
用于薄层层析法测定单糖组成的一份水解样品，蒸干三氟乙酸后，加入1 mL甲醇溶解蒸发皿底部的样品，用移液枪将其转移至1.5 mL的塑料离心管中，待用。将硅胶板水平放置，在距薄板一端2 cm处用铅笔画一直线，在直线上，以1.0 cm间隔打点作为点样位置。并在每个点下方标明标样或样品名称。分别点上标样及待测样品（水解后的多糖），待测样品点样量为10 μL。层析缸内加入展层剂，液面高度约为0.5 cm。将硅胶板在此密闭装置中展层。观察溶剂跑至距硅胶板顶端约1 cm时，从层析缸中取出硅胶板，记录溶剂前沿。将硅胶板用吹风机吹干，然后用喷雾器向板上喷洒显色剂（苯胺—邻苯二甲酸正丁醇饱和水溶液），100 ℃烘箱中放置15 min，即显现各斑点。测量每个斑点中心距离加样原点的距离，计算相对迁移率（Rf值）。通过与标准品单糖的Rf值比较，初步判断样品中含有的单糖种类。
用于高效液相色谱法测定单糖的一份水解样品，蒸干后加入0.5 mL 0.3 M的PMP试剂和0.5 mL 0.3 M的NaOH溶液，充分混匀。取0.1 mL样品置于15 mL 塑料离心管中，70 ℃水浴30 min。每组做5管。 待冷却后，取其中3个管，分别加入 0.3 M盐酸溶液0.05 mL和超纯水0.05 mL，充分混匀，将这3个离心管中的液体合并于其中一个离心管。加入0.7 mL三氯甲烷进行萃取，混匀后离心，弃去有机相（下层），保留水层。重复萃取过程2次。合并水层。 水层经0.22 μm滤器过滤后，用HPLC进行单糖组成分析。岛津LC-10ATvp泵，岛津SPD-10Avp紫外检测器，岛津色谱柱，流动相为PBS（0.1 M，pH 7.0）：乙腈=82.2：17.8（v/v），流速为1.0 ml/min，自动进样，检测波长为245 nm。与标准糖样的各保留时间相比较，确定刺五加多糖可检测出Rha、GlcUA、GalUA、Glc、Gal、Ara；由于摩尔含量和峰面积成正比，故根据检测出的各种单糖的峰面积，可以计算得到刺五加多糖中各种单糖的摩尔含量比。
1.4.4 相对分子量分布
将10 mg样品（①标准糖样混合物为每种各取2 mg左右，②待测样品）溶于1 ml缓冲液中，离心除去不溶物质。用Sepharose CL−6B柱层析法测定样品的相对分子量分布。Sepharose CL−6B层析柱的条件：层析柱流速为0.2 ml/min，收集器调为15min/管收集。洗脱柱中依次加入蓝色葡聚糖、重铬酸钾及相对分子量为15.3万的葡聚糖标准品混合物，相对分子量分别为7万和46.1万的葡聚糖标准品混合物，实验制备的多糖样品。洗脱完毕，用苯酚-硫酸法测多糖的相对分子量分布。

2 结果与分析
2.1 粗多糖回收率测定
称取刺五加原样为30.3g，得到粗多糖样品为0.3662g。所以，此次回收率为1.21%。

2.2 多糖含量测定

图一 葡萄糖标准曲线
待测样品
1
2
3
平均值
吸光值
0.250
0.257
0.280
0.2535
表一 待测样品吸光值结果
由标准曲线公式y=1.2526+0.0690可以求得待测样品的浓度为0.0147mg/mL。所以，提取出的粗多糖中单寡糖与多糖的含量为14.7%。

2.3 薄层层析
测量每个斑点中心距离加样原点的距离，计算相对迁移率（Rf值）。通过与标准品单糖的Rf值比较，初步判断样品中含有的单糖种类。

图二 薄层法测定结果

样品
木糖
葡萄糖
阿拉
伯糖
甘露糖
半乳糖
半乳糖醛酸
5mL
样品
10mL样品
15mL样品
总距离
距离
3.00cm
2.00cm
2.20cm
2.30cm
1.75cm
1.25cm
2.25cm
2.15cm
2.25cm
6.50cm
Rf
0.46
0.31
0.34
0.35
0.27
0.19
0.35
0.33
0.35
—
表二
由图表中可知，三种不同浓度的样品Rf值在0.30—0.35之间，与标准品单糖的Rf值比较，初步判断样品含有的单糖种类有葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖三种单糖。
2.4 高效液相色谱

图三 标准混样的高效液相色谱图谱

Detector A (245nm)
Pk #

Retention Time
Area
Height
2
Man
19.220
549765
20308
3
Rha
26.715
726090
20161
4
GalUA
32.510
876788
19488
5
Glc
39.603
568385
9976
6
Gal
45.512
1852460
30421
7
Xyl
47.266
1515474
24209
8
Ara
50.273
1477700
22244
表三 混合标样的高效液相色谱分析结果

图四 待测样品的高效液相色谱图谱

Detector A (245nm)
Pk #

Retention Time
Area
Height
11
PMP
12.459
81678898
2808190
12
Man
17.241
959521
37759
14
Rha
24.317
619152
13256
15
GalUA
28.870
270192
5564
16
Glc
34.997
18363041
369220
17
Gal
40.068
3825279
70934
18
Xyl
41.868
506664
9338
19
Ara
44.407
1241262
21191
表四 待测样品的高效液相色谱分析结果

与标准糖样中各保留时间相比较，确定刺五加多糖中可检测出甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖7种单糖。由于摩尔含量和峰面积成正比，故根据检测出的各种单糖的峰面积，可以计算得到其摩尔含量比为Man：Rha：GalUA：Glc：Gal：Xyl：Ara=4：2：1：71：15：2：5。

2.4 Sepharose CL−6B层析柱测定相对分子量分布
柱高：96.0cm
柱体体积=﹙1.5/2﹚²×π×96.0＝169.56cm3
利用苯酚—硫酸法测定样品峰值，得到以下数据：

管数
体积
洗脱体积
蓝葡聚糖
19管
57cm3

重铬酸钾
53管
159cm3

15.3万葡聚糖
38管
114cm3
57cm3
46.1万葡聚糖
28管
84cm3
27cm3
待测样品
51管
153cm3
98cm3
表五

由公式 Kav=（Ve—Vo）/（Vt—Vo）可得，
15.3万葡聚糖的Kav=0.51
46.1万葡聚糖的Kav=0.24

图五 标准曲线
待测样品的Kav=0.87
所以，由标准曲线得知，待测样品的相对分子量为3.47万，即刺五加多糖的Mr为3.47万。

3 讨论
本组通过水提法得到的刺五加粗多糖的回收率为1.21%，较其他组的回收率高，分析原因有两个，一是在浸提过程中我们组采用80摄氏度左右的火力加热，浸提时间也较长，使得刺五加中的成分更多地溶于水中，从而获得较多的粗多糖；另外，在浸提过程中，过滤后的滤液中还是有很多不溶物，导致所得的样品较多。
在多糖含量测定中，利用苯酚—硫酸法提取出的粗多糖中单寡糖与多糖的含量为14.7%。我们的三个待测样品中，有一个样品的数据较另外两个值较大，说明有较大偏差，因此平均值只用两个值求得。
利用薄层层析法分析单糖组成，初步判断样品含有的单糖种类有葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖三种单糖。而高效液相色谱法分析单糖组成，与标准糖样中各保留时间相比较，可检测出甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖7种单糖。由于摩尔含量和峰面积成正比，故根据检测出的各种单糖的峰面积，可以计算得到其摩尔含量比为Man：Rha：GalUA：Glc：Gal：Xyl：Ara=4：2：1：71：15：2：5。可知，葡萄糖的含量最多，甘露糖的含量次之，其余五种单糖的含量较少。两种方法相比较，高效液相色谱法更加灵敏、准确，但是薄层层析法的操作相对简单。
Sepharose CL−6B层析柱测定相对分子量分布测定多糖的相对分子量约为3.47万道尔顿。在做标准曲线时，我们组只测出15.7万道尔顿和46.1万道尔顿大小的葡聚糖的峰，缺少7万道尔顿大小的葡聚糖的峰。分析原因是可能7万的葡聚糖最后跑出来的含量太少，导致在利用苯酚—硫酸法测定该峰时，样液浓度较低，从而没有测出峰所在位置；也有可能是我们组在测定峰值时操作存在问题导致没有测出7万葡聚糖的峰的所在管数。另外，其他组的待测样品最终测出两个峰，即有两种多糖。我们组只有一个峰，即只有一种多糖。分析原因：我们组的结果应该也至少有两种多糖，只是由于浓度太小而没有测出。我们组在利用苯酚—硫酸法测定时，没有将所有的管都检测，只是有选择地进行测定，这个过程中必然存在遗漏，从而导致只测出一个峰值。

参考文献
［1］马　莉,唐健元，李祖伦,刘　毅,金　城,赵艳玲,肖小河等 板蓝根多糖分离纯化及其性质的研究　Chinese Traditional and Herbal Drugs　2007 年8月第38卷第8 期：1143—1146
［2］孟繁磊,陈瑞战,张 敏,陈瑞平等 刺五加多糖的提取工艺及抗氧化活性研究 食品科学 2010,31（10）:168—174