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几种蛋白原料的体外消化率的测定方法的比较
摘 要 试验分别采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法、肉食性鱼类（如鲈鱼）消化道粗酶提取液消化法和草食性鱼类（如草鱼）消化道粗酶提取液消化法测定了酪蛋白、鱼粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉等7种蛋白质原料的体外消化率。3种测定方法中，鱼粉的消化率差异不显著（P＞0.05）；豆粕、菜籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉用两步法和草鱼消化酶法测定的消化率无显著差异（P＞0.05）；棉籽粕消化率用两步法测定值高于用消化酶法的测定值，差异极显著（P＜0.01）；豆粕、菜籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉的消化率用两步法比用鲈鱼消化酶测定的值高，差异极显著（P＜0.01）；草鱼消化酶法和鲈鱼消化酶法对酪蛋白的消化率无显著差异（P＞0.05），而对于豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉草鱼消化酶法测定值高于鲈鱼消化酶法的测定值，差异极显著（P＜0.01）。结果表明，胃蛋白酶-胰蛋白酶两步体外消化法在测定鱼粉蛋白质消化率时可以替代鱼类消化液粗酶消化法，对于其它蛋白质原料使用该方法应慎重。
关键词 蛋白质饲料；体外消化率；测定方法中图分类号 S816.32

　　消化率是动物从食物中所消化吸收的部分占总摄入量的百分比，是评价饲料营养价值的重要指标之一。测定饲料消化率主要有两种方法：体外法和体内法。体内法测定的消化率能够比较真实的反映鱼类对饲料的消化情况。但体内法测定方法复杂、时间长、费用高，而且对外界环境的要求较高，季节、温度、光照等都会影响消化率测定值。体外消化法是利用精制的消化酶或研究对象的消化道酶提取液在试管内进行的消化试验，其测定值可近似反映鱼对饲料的消化率。此法能快速测定原料的相对利用率，为营养师制作配方提供参考[1]。然而，体外消化法无法反映体内消化的真实情况。Boisen 和Eggum（1991）在胃蛋白酶-胰蛋白酶两步法中利用标准过滤装置测得饲料蛋白质消化率与鼠和猪的真消化率十分接近，他们认为这种方法测得的蛋白质体外消化率经内源氮校正与回肠末端蛋白质表观消化率高度相关。我国饲料原料品种多，营养成分含量差异大，加工方式各异，饲料原料对不同鱼类的营养价值差异更大。由于鱼类生活在水中，测定鱼类饲料真消化率比测定畜禽的更加困难。所以寻找一种准确、简便、实用的消化率测定方法对评价鱼类饲料的消化率有着十分重要的意义。本试验采用胃蛋白酶-胰蛋白酶两步体外消化法以及从肉食性和草食性鱼类的消化道提取消化酶在体外消化饲料的方法，测定了7种常用蛋白质饲料原料的消化率，为饲料生产者配制鱼用饲料提供基础数据，同时为体外测定鱼用蛋白质原料消化率提供参照。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 饲料原料
酪蛋白、鱼粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、酵母粉和玉米蛋白粉，均为经105℃烘干处理的样品，粉碎过60目筛后保存备用。
1.1.2 主要试剂
硫酸（GB  625—77）、硫酸铜（GB  665—78）、硫酸钾（HG 3—920—76）和氢氧化钠（GB 629—77），均为分析纯。
硼酸（GB 628-78）（分析纯）：2g溶于100ml水配成2%溶液（W/V）。
混合指示剂：甲基红（HG 3—958—76）0.1%乙醇溶液，溴甲酚绿（HG 3—1220—79）0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉处保存期三个月以内。
0.05mol/l HCl溶液：取4.2ml浓盐酸，用蒸馏水定容至1L。
标定甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：取20 ml 0.1%甲基红酒精溶液，与20ml 0.5%溴甲酚绿酒精溶液，混匀。
胃蛋白酶活性为1：10 000；胰蛋白复合酶活性为2 500IU/mg；鲈鱼消化道混合液；草鱼消化道混合液；双抗为青霉素G钾盐（150 IU/ml）和硫酸链霉素（150IU/ml）；14%磺基水杨酸钠。
1.1.3 主要仪器
实验用样品粉碎机、分析筛（孔径0.60mm）、分析天平（感量0.001g）、滴定管（酸式，100ml）、电炉、消化炉、电热式恒温烘箱、干燥器、凯氏蒸馏装置、过滤装置、磁力搅拌器、离心机、恒温水浴振荡器等。
1.2 试验方法
     1.2.1 原料蛋白质测定
     1.2.1.1 消化
称取0.6～0.7g（准确至0.001g）试样，无损失地放入消化瓶中，加入无水硫酸钠和硫酸铜的混合物[m（CuSO4·5H2O)：m(Na2SO4)=1：9]6g，与试样混合均匀，再加浓硫酸20ml，在消化炉上小心加热，起初电压调大，冒烟时调小电压，大量冒烟后再调大电压，加热至样品呈透明的浅蓝色或白色为止，关上电源，使消化瓶自然冷却。而后，用蒸馏水冲洗消化瓶，洗液注入100ml容量瓶内，定容。同时做一个空白对照试验。
     1.2.1.2 蒸馏
连接好凯氏蒸馏装置，加热使之产生蒸汽。取20%硼酸溶液20ml置于150ml三角瓶内，并加混合指示剂1滴，然后将其置于冷凝管下。吸取消化稀释液10ml，由漏斗处加入反应室内，再加40% NaOH溶液10ml。使蒸汽进入反应室，加热蒸馏，直至三角瓶内硼酸溶液增加1倍体积，移开三角瓶，停止加热。将空白对照的消化液做同样处理。
     1.2.1.3 滴定
用0.05 mol/l盐酸标准溶液滴定，到接收液由绿色变为灰红色即是终点。同样滴定空白实验的接收液。
     1.2.1.4 计算

式中：CB——含氮量；
        NHCl——滴定所用盐酸的浓度；
        V1——试样滴定时所需酸标准溶液的体积（ml）；
        V2——空白滴定时所需酸标准溶液的体积（ml）；
        m——试样的质量（g）。
   1.2.2 消化液测定法
     1.2.2.1 胃蛋白酶最适量的选择
分别取0.5g豆粕置于3个三角瓶中，各加入含不同胃蛋白酶活性单位（100IU、160IU、200IU）的pH值为1.4的0.05mol/l HCl-KCl缓冲液30ml，在40℃台式恒温摇床上保温3h后过滤，多次冲洗残留物，用凯氏定氮法测定残留物的蛋白质含量。计算饲料蛋白质消化率，确定出胃蛋白酶的最适用量为160 IU（表1）。
1.2.2.2 胰蛋白酶最适用量的选择
分别取0.5g豆粕置于3个三角瓶中，用含有胃蛋白酶浓度为0.05mol/l的HCl-KCl缓冲液做前处理，之后加0.2mol/l的氢氧化钠溶液处理消化液使之pH值等于6.8。再分别加入含不同胰蛋白酶活性（100IU、150IU、200IU）的0.05mol/l的KH2PO4-NaOH缓冲液。继续培养3h，测定饲料的蛋白质消化率，确定出胰蛋白酶的最适用量为150IU（表2
1.2.2.3 离体消化程序
    ①胃蛋白酶处理
    a.称取0.5g饲料样品2份，分别置于250 ml带盖三角瓶中（每个样品测2个平行样）。
    b.准确称取1.777g胃蛋白酶（准确到0.001g），置于体积100ml、pH值1.4的HCl-KCl缓冲液中。
    c.用移液管移取30ml上述混合液置于三角瓶中。
    d.将三角瓶置于（40±0.1）℃台式恒温摇床中，以其温度达到40℃时开始计时，震荡3h，频率为80次/min。
    ②胰蛋白酶处理
    a.准确称取4mg胰蛋白酶（准确到0.001g），置于体积1 000ml、pH值6.8的KH2PO4-NaOH缓冲液中，放入冰箱中备用（温度为4～6℃）。
    b.从摇床中按顺序取下三角瓶，用0.2mol/ml NaOH溶液滴定消化液，使其pH值6.8，各量取15ml KH2PO4-NaOH缓冲液置于三角瓶中，然后再分别用移液管吸取15ml KH2PO4-NaOH-胰蛋白酶混合液置于另一个三角瓶中。
    c.继续在（40±0.1）℃下震荡培养3h。
    d.用320目尼龙滤布和抽滤装置过滤消化液，并用温水反复冲洗培养用的三角瓶（3～4次），将洗液加入消化液中过滤，用洗瓶多次冲洗滤渣。
    e.将滤渣放入65℃恒温烘箱中烘干1h。
    f.用凯氏定氮法测定滤渣的含氮量，计算消化率。
    ③空白试验
按上述各步骤进行，但不加入样品，测定胃蛋白酶-胰蛋白酶复合处理空白试验的含氮量。
     1.2.2.4 体外消化率计算方法
粗蛋白消化率（%）= 100×（饲料样品粗蛋白含量-消化后滤渣粗蛋白含量）/饲料样品粗蛋白含量
   1.2.3 消化酶提取法
      1.2.3.1 粗酶液的提取
按照常规方法解剖取出鱼的肠道和肝胰脏，去除脂肪和肠道内容物后，用0.2M、pH值7.4的磷酸缓冲液按W/V为1：20稀释，并用玻璃匀浆器匀浆后，在3 500r/min下离心20min，取上清液作为粗酶提取液，冷冻保存于冰箱中备用。
      1.2.3.2 离体消化率的测定
准确称量过80目的样品各0.400g，放入100ml带塞三角瓶中，加0.02M、pH值7.4的磷酸缓冲液40ml，粗酶液10ml，加入双抗（青霉素150IU/ml、硫酸链霉素150IU/ml）。每隔4h加双抗一次，置于（28±1）℃的恒温生化培养箱中，在以50次/min震荡的摇床上进行离体消化12h。每个样品分别作2个平行样。
      1.2.3.3 离体消化率的计算
鱼类消化道的粗酶液离体消化12h后终止反应，用定量滤纸过滤，并用温水冲洗3～4次，取滤渣（含滤纸）在105℃下烘干至恒重并准确称重。凯氏定氮法测定饲料原料及其消化后相应滤渣的粗蛋白含量。
粗蛋白消化率（%）= 100×（饲料样品粗蛋白含量-消化后滤渣粗蛋白含量）/饲料样品粗蛋白含量
2 结果
      2.1 饲料的粗蛋白含量
试验所用的饲料原料采用凯氏定氮法测得其粗蛋白含量（见表3）。

2.2 饲料粗蛋白的体外消化率
消化液测定法（即胃蛋白酶-胰酶两步消化法）、消化液提取法（提取鲈鱼和草鱼两种消化液）测得的蛋白质饲料消化率见表4。
3 分析与讨论
      3.1 蛋白质饲料原料
由表4可知，两步法中酪蛋白的消化率最高，为96.9%；其次为棉籽粕和豆粕，其消化率分别为90.2%、89.9%；玉米蛋白粉、鱼粉的消化率分别为83.4%和80.7%；酵母粉、菜籽粕的蛋白质消化率均低于80%。试验测得的常用蛋白质消化率，与其他学者报道的有关体外消化率结果十分接近。酪蛋白、豆粕的消化率略低于pH值恒定法和体外消化法的测定值[4，5]。从鲈鱼消化酶对蛋白质饲料的消化率来看，酪蛋白最高为86.2%，其次为鱼粉83.8%；在植物蛋白饲料中豆粕较高，接近于鱼粉的消化率，为81.8%，而菜籽粕和棉籽粕的消化率较低，均小于50%；酵母粉和玉米蛋白粉的消化率最低，分别只有38.4%、36.3%。草鱼消化酶对蛋白质饲料的消化率数据显示，酪蛋白仍然是最高的，为90.4%；其次为豆粕、菜籽粕和鱼粉，分别为87.5%、 86.2%、 84.0%；玉米蛋白粉和棉籽粕的消化率为77.1%和75.2%；酵母粉的消化率最低，只有68.5%。值得注意的是，豆粕、菜籽粕的消化率均高于鱼粉，这主要是由其草食性鱼类的特点决定的，本试验与罗莉等（1997）测定的结果相一致[6]。饲料及其蛋白质在鱼体消化道中被消化的程度取决于消化酶（消化蛋白质的主要是蛋白酶）的作用时间，消化速度受消化酶的浓度、温度、底物和作用时间的影响[11]。由鲈鱼消化酶的试验结果可知，其对鱼粉具有很好的消化效果，而在3种植物蛋白饲料中，对豆粕的消化效果最好，其次为菜籽粕，对棉籽粕的消化效果最差。这与原料的种类和性质有关。
      3.2 体外消化率测定方法
不同的消化方法测定的粗蛋白消化率存在显著差异（P<0.05）。用两步法测得的消化率普遍高于消化液提取法，前者的消化率在75.4%～96.9%之间变化，而后者用两种消化液测得的消化率分别为36.3%～86.2%（鲈鱼消化液）和68.5%～90.4%（草鱼消化液）。在同一消化方法中，饲料的消化率之间也存在着显著差异（P<0.05）。酪蛋白、鱼粉、豆粕粗蛋白的消化率较高，均大于80%。两步法中粗蛋白消化率的变化辐度为21.5%，鲈鱼和草鱼消化率的变化辐度为49.9%和21.9%。对鲈鱼而言，植物蛋白饲料的消化率要远远小于动物蛋白饲料，这主要是由其肉食性的特点决定的。相反地，两步法和草鱼消化液的数据则比较接近。两步法消化体系得到的消化率值高于使用消化液的消化体系。目前体外消化率测定尚无统一方法，各种消化法中选用的酶的种类及酶活力都存在不同，消化条件（温度、pH值、消化时间）、消化产物的分解以及测定方法也不同，这些因素可能影响消化率的测定结果。本试验中的一些蛋白质消化率高于动物体内测得的结果，相应饲料的消化率高于印遇龙测得的猪回肠末端蛋白质表观消化率。体外消化率是以消化后所有可溶性氮作为可消化的蛋白质来计算的[7]，而表观消化率是以回肠末端食糜中所有氮作为不可消化蛋白质计算得出的，但并非回肠末端的食糜氮都是不可消化的饲料蛋白质[8]，两种消化方法涉及到内源氮的差别，这可能导致本试验测定值略高于印遇龙[7]的结果。Boisen研究认为，对体外消化率进行内源氮校正后，可以准确地预测回肠末端蛋白质表观消化率[2]，若对不同类别的饲料再考虑到灰分、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维等成分，预测结果将会更准确[9]。目前，许多研究表明，两步消化法测得的蛋白质消化率与动物体内消化法测得的蛋白质真消化率高度相关[8-10]。胃蛋白酶-胰酶两步体外消化法可用于蛋白质的测定，测定值不受内源氮的影响。从草鱼消化酶的试验数据可知，作为草食性鱼类，其对豆粕、菜籽粕的消化率要高于对鱼粉的消化率，这主要是由鱼体消化道和消化酶的特性所决定的。因此，在配制草食性鱼类的人工养殖饲料中，可以适当地减少鱼粉的用量，增加豆粕等植物蛋白质饲料的用量，不仅节省成本，也符合草食性鱼类的消化规律。肉食性鲈鱼对豆粕有很好的消化作用，从鲈鱼消化酶对蛋白质饲料的体外消化率来看，豆粕的结果与鱼粉的结果较接近。因此，在配制肉食性鱼类的人工养殖饲料中，可以适当地增加豆粕的用量，而尽量减少鱼粉等动物蛋白质原料的用量，既有利于降低饲料成本，又能有效改善鱼体的品质、降低饲料物质对水域环境的污染（鱼粉的总磷很高、但利用率很低）。

4 结论
胃蛋白酶-胰酶两步体外消化法在测定鱼粉蛋白质消化率时可以替代鱼类消化液粗酶消化法，对于其它蛋白质原料使用该方法应慎重。
参考文献
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11 向枭，叶元土，周兴华，等.铜鱼肠道、肝胰脏对四种蛋白质饲料的离体消化率测定.饲料工业, 2003，24(1): 50～51