waters高效液相色谱.doc

Waters高效液相色谱操作说明
一． 简介
本高效液相色谱实验包括：waters1525泵+waters2487双波长检测器+色谱柱+电脑（breeze图谱处理软件）+流动相

二． 操作流程
0.准备工作
确定色谱实验方法，处理好流动相1，换好流动相，确定色谱柱选择无误
1.开机
打开泵开关，听到两声“嘀”的响声之后，再打开波长检测器。检测器进入预热阶段（此时检测器面板进入5min倒计时）这期间打开电脑，进入英文windows操作系统2，待检测器自检完毕（整个自检过程约6~7min），打开电脑桌面的（Breeze软件）。待程序完全启动，整个开机过程结束。系统默认进入上次使用的方案。
2.建立新方法和新方案
2.1新建方案
方案主要用来储存你的各个实验方法，数据等内容，你可以把它理解为一个文件夹。
2.1.1创建步骤
选择→单击→单击"next"→在"project name"中输入方案名称（如abc），"comments"中可填注释，也可不填。→单击"finish"
2.1.2打开创建的方案
在界面下→单击→在"project"中找到你创建的方案（如abc）→点击"OK",即进入到我们自己的方案中了
2.2新建方法
在新建的方案中，需要建立不同的试验方法。试验方法主要设定的包括洗脱方式，检测波长等参数。
2.2.1新建方法步骤
单击→单击→单击（Flow选项卡）→在programmed flow中设定你的洗脱方式（此步在2.2.2详述）→单击→单击（channel 1选项卡）→在"wavelength"框内设定你的检测波长（如265nm,280nm,215nm等等）→（设定结束，保存）：单击→输入方法名称如（abc 1）→单击"save"3
2.2.2洗脱方式的设定（重要）
在programmed flow中可看到。其中Isocratic为等度洗脱，Gradient为梯度洗脱。以下我们来分述。
2.2.2.1若你用等度时Isocratic）："pump mode"中选择"Isocratic"
表格中"Isocratic Flow A"为流动相A的流速,"Isocratic Flow B"为流动相B的流速，"Total Flow"为总流速。
例如：假设方法要求用乙腈做A相，用纯水做B相，乙腈占70%，水占30%，等度，则：

2.2.2.2若你用梯度时（Gradient）："pump mode"中选择"Gradient"
表格中第1行默认已有，单击下面空白行处添加新行。
"Time"为时间，即此行开始时间；"Flow"不作更改，保持1ml/min的总流速；
%A处填A相比例；%B处填B相比例；curve处为曲线型号，一般不变。
例如：假设用方法要求乙腈做A相，用纯水做B相，0—10min乙腈从100%到50%；10—30min乙腈从50%到40%；30—60min乙腈从40%到80%；则：

洗脱设置完毕继续按照2.2.1完成方案的创建。
3.洗泵和平衡
方法设定完毕，我们还要进行洗泵与平衡两项工作，让机器做好进样前的准备。
3.1洗泵
在更换流动相，第一次使用机器，长时间未使用的情况下需要进行洗泵的工作。步骤如下：单击（purge pump）→"next"→按指示图操作：打开泵面板，取塑料注射器，扭开排液阀旋钮，用注射器抽取泵中液体10ml左右（无气泡即可），反向扭紧旋钮，取出注射器。根据需要灌洗AB泵。单击"next"→按图示操作：向左打开参比阀，单击"next"→（即是对AB泵以默认的5mi/min的流速进行冲洗，若只充一个泵，只选一个即可。）默认冲洗时间5min，5min后自动停止，向右关紧参比阀→"finish"结束洗泵
3.2平衡
洗完泵后，还要将色谱柱内杂质洗净。所以我们需要进行平衡。在每次进样前，我们都必须洗平衡。步骤如下：单击(equilibrate)→在弹出的对话框选择所需方法（一般为你的实验方法，如abc1）→待基线稳定，且达到小数点后5位数字4的时候，即可停止洗平衡（一般十几钟到几十分钟不等）→(abort)
4.进样
平衡好之后，即可进样（请先将注射器中样品准备好5）进样步骤如下：单击(single injetion)→在出现的对话框中输入进样名称，方法，进样体积（一般为10ul），时间等内容，例如设置好之后→单击"inject"按钮→等到操作动画出现时，将进样环手柄搬到load位置，平稳插入微量注射器，均匀恒速注入样品液，除另有规定外，不应立即取下注射器，手柄搬到inject位置，即开始出现图像→点击(send date to review)出现大视图→等到样品跑结束，自动出现结果图。（中途可以按中止(abort)停止进样

5.数据处理
得出了色谱图，下一步就是对色谱图各峰的统计，并得出最终结果。
5.1统计各峰时间，面积，高度等内容。步骤如下：
单击→
接着单击（channels选项卡）找到你需要处理的内容双击打开6→单击（processing parameters wizard）→选择，单击"ok"→可输入统计开始时间和结束时间，也可不输，单击"next"→注意不要选上，单击"next"→可输入统计最小面积或最小峰高，也可不输，单击"next"→单击"next"→单击"next"→单击"next"→单击"next"→输入名称，单击"finish"→出现统计表格：此时建议右键选中某些不重要的行，并单击"delete row(s)"进行删除，只留下需要的几行数据即可→点击（save all），统计操作结束。
5.2得出结果图。步骤如下：
点击→
点击
（results选项卡）找到你需要处理的内容,右键单击那一个结果行→单击(preview)→
对话框中选（也可以选第三个自己选择显示模式，但一般选择第二个即可），单击OK→单击（print）即打印出来实验结果（当然也可以保存此实验报告，单击file→单击save report即可）
6.关机
关机前用纯有机相（最好是甲醇）洗平衡以保存柱子。洗干净后停止平衡→单击"file"→单击"exit"→弹出单击"OK",关闭软件，关闭波长检测器，最后关掉泵及总电源。

注释1~6
1. 流动相的前处理：一般来说，流动相与试液均需过滤与除气泡后才能进入色谱。过滤：用注射器加滤头进行过滤，或者用专用过滤装置。除气泡：将过滤后的流动相或试样放在超声波里超声30min以上，至无气泡逸出即可。
2. 英文windows系统：学校电脑即是开机的第一个默认的windows，无需选择，直接按回车进入系统即可
3. 存储过你的方法之后（如abc 1），下次开机，打开你的方案（如abc）之后，可在"view method"中找到你保存的方法（单击"file"→单击"open"，再找到打开即可）。方法也可进行更改，更改后可以选择覆盖保存于另存为。
4. 平衡结束需要满足以下两个条件：
（1）平衡图像已经稳定，没有出峰的迹象了（可在平衡时使用图像左侧的按钮，在激活状态下按右键可以调出更改时间坐标的对话框：，更改数字即可改变时间坐标显示范围，便于判断是否还有出峰迹象）
(2)平衡图像纵坐标是否稳定在小数点后五位或更多位。如下图，即纵坐标数字已到达小数点五位，即可。
5. 微量注射器在吸取样品前应先用纯有机相洗（如纯甲醇），再用样品润洗三次并除去针管内起泡后，吸取10ul样品备用（针头的残叶可用滤纸擦去）。实验结束前用纯有机相洗干净注射器内壁（也就是反复抽取几次），再把注射器装好。
6. 所有的实验图，方法，结果，都可在"find data"中的相应选项卡中找到，如我们之前提到的"channels"

三． 注意事项
1.每次必须在洗好平衡之后才能进样
2.若流动相为酸性物质，PH不要低于2.1，否则会损伤C18柱
3.随时注意流动相的量，不能让滤头露出流动相，暴露在空气中。流动相不足时尽快更换或补充，更换时尽量轻缓，防止产生气泡。另外记住流动相与试样都需要过滤与超声之后再使用
4.废液瓶满了注意移除废液。
Zzd
2011.05
2.11 用液相色谱法测琥珀酸的含量
发酵过程中,伴随产物琥珀酸生成的同时还有其生成途径上的有机酸(如苹果酸、富马酸) 和其它代谢途径上的有机酸(如甲酸、乙酸、乳酸) 作为副产物而释放到环境中，可能会影响琥珀酸含量的测定。我们选用ZORBAX SB-C8 色谱柱, 建立了高效液相色谱法测定产琥珀酸发酵液中有机酸的方法，分析速度快, 精密度较高。
2.11.1 实验的仪器与试剂
美国公司生产的高效液相色谱仪，包括1525型泵，2487型紫外检测器，ZORBAX SB-C8柱（water公司生产），PH－2型酸度计
试剂：高纯水、HPLC级甲醇（北京化工厂）、色谱标准品琥珀酸

2.11.2 色谱分离条件
色谱分离柱: ZORBAX SB-C8 , 5μm，4.6 mm×250 mm
保护柱: HP hypersil ODS C18, 5μm, 2.1 mm×20 mm
流动相: 0.005 mol/L 硫酸水溶液, pH 2.5(用氨水调节)
流动相流速: 1 mL/min
检测器: 可变波长检测器；紫外波长：210 nm
进样量: 20μL；柱温：30℃
2.11.3 条件选择
1 检测器的选择
培养基组分通过可变波长检测器(VWD)可检测到多种物质,这是由于培养基中所含有的各种氮(肽、氨基酸等)、糖类、脂类和维生素等成分在紫外波长范围内均有较强的吸收,故这些物质在VWD 中的图谱影响了对产物琥珀酸酸的检测,尤其是琥珀酸含量很小样品无须稀释的情况下使用VWD 很难对其进行定性与定量分析。而培养基组分在示差折光检测器(RID)中的出峰并不影响该检测器对目标物质的检测。另外,采用VWD分析培养基样品需要25min ,而使用RID只需9min。因此,与VWD相比,使用RID分析乳酸发酵液样品不仅排除了其它杂峰对产物乳酸检测的干扰,而且分析速度快,故本研究选用RID[26]。
2 流动相的选择
分别以5 mmol/L H2SO4 溶液和5 mmol/L H3PO4 溶液作为流动相对葡萄糖和3 种有机酸混合标准溶液进行分离,实验结果表明两种溶液均可以作为流动相分离葡萄糖和有机酸混合标准样品,在两种流动相条件下,各物质的出峰顺序和出峰时间相近。本研究选用0.005 mol/L H2SO4 溶液作为流动相[26]。
3 流动相pH 的选择
各有机酸的保留时间随着流动相pH的增大而普遍减小,而葡萄糖的保留时间几乎不发生变化。通过计算确定,当流动相pH 2.5时,各物质之间的分离度最大。从填料本身来看,其使用范围在pH 2.0～8.0,在强酸强碱条件下,硅胶基体本身要受到破坏,键合相也会受到损失,因此,采用pH 2.5的流动相是安全可靠的。本研究确定pH2.5为各物质的最佳分离酸度[26]。
4 流动相的浓度与流速
各物质的出峰时间及出峰顺序均无多大差异,但由于较高浓度的流动相对色谱柱和输液泵会造成一定程度的损害,故采用低浓度为宜,所以本实验采用0. 005 mol/L H2SO4溶液为流动相,而且在每批进样分析结束时,及时使用水和甲醇冲洗柱子,以免损坏色谱柱。经对不同流动相流速分离混合酸标准溶液的比较,确定最终流速为1 mL/min [26]。
2.11.4 样品预处理
将发酵液过滤，进行适当稀释。取 5 mL 滤液,离心(10000 r/min, 10 min) 除去菌体和不溶物，取1 mL上清液用超滤膜离心（3000 r/min, 10 min）即得到待测液。
2.11.5 流动相配制
取0.27mL 浓H2SO4 (AR)用水稀释定容至1000mL（5mmol/L），用氨水调pH2.5，后用0.45μL孔径水膜进行真空抽滤，再超声脱气即可。
2.11.6 标准溶液配制
精确称取一定量的色谱纯的琥珀酸，用超纯水配制成标准溶液，浓度分别为：100mg/L ，200mg/L，1g/L