细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell).doc

迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8m，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置3730min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。2.2制备细胞悬液制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿1224h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗12遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5105/ml。2.3接种细胞取细胞悬液100l加入Transwell小室。24孔板下室一般加入600l含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。培养细胞：常规培养1248h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。2.4结果统计直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。实验材料（1）Transwell chamber: 24-well, 8.0-m pore membranes (Corning) （2）细胞培养相关试剂：无血清培养基，10血清培养基，PBS，0.02EDTA（3）固定液：甲醇（4）染色液：Giemsa染液（5）封片剂：中性树胶（6）其他：小镊子，棉棒，载玻片，盖玻片操作步骤（1）所有细胞培养试剂和Transwell chamber 放在37温育；（2）待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2105 /ml；（3）在下室（即24孔板底部）加入600800l 含10血清的培养基，上室加入100150l细胞悬液，继续在孵箱培养24小时；（4）用镊子小心取出chamber，吸干上室液体，移到预先加入约800l甲醇的孔中，室温固定30分钟；（5）取出chamber，吸干上室固定液，移到预先加入约800l Giemsa染液的孔中，室温染色1530分钟；（6）轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出chamber，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞；（7）用小镊子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至载玻片上用中性树胶封片；（8）显微镜下取9个随机视野计数，统计结果。注意事项（1）根据待测细胞体积大小选择合适孔径的chamber。常用的为8.0-m孔径（如AGS细胞），如果细胞体积较大可以考虑用10-m孔径；（2）根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。常规24-well chamber接种细胞数约为25104/well，迁移时间1236小时；（3）由于Corning公司的24-Transwell内含12个独立的chamber，为了避免操作污染，每次实验可预先另准备一块24孔普通培养板（Corning）；（4）如果细胞迁移能力较弱，下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得的上清加50g/ml FN（Fibronectin），具体可查阅相关文献；（5）细胞悬液加入膜中央，尽量保证液面水平；（6）固定染色擦洗时动作小心，避免擦去膜底面的细胞。但一定要充分擦净膜表面上未迁移的细胞，以免影响读数。尤其是膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗，但要小心避免将膜戳破；（7）Chamber和膜上都无法标记，操作时应小心避免混淆实验组和对照组；（8）充分晾干，避免残留水分导致镜下聚焦不一致。细胞侵袭实验 （cell invasion assay）实验材料（1）Matrigel (BD 5mg/ml)，-20保存（2）其余材料同迁移实验操作步骤（1）Matrigel在4过夜融化；（2）用4预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml，冰上操作；（3）在chamber上室底部中央垂直加入100l稀释后的Matrigel，37温育45小时使其干成胶状；（4）后续步骤同迁移实验（1-8）。注意事项（1）Matrigel在过高或过低的温度均易凝固，因此操作所需枪头和离心管应提前在4预冷；（2）铺胶时保证液面水平，胶的厚度均匀一致，切勿产生气泡；（3）其他注意事项同迁移试验。其他Transwell做肿瘤侵袭实验的具体步骤(1) 基质胶准备：将冻存于80度冰箱的BD matrigel 4度过夜（24h），变成液态；（2）取300ul无血清培养基，加入60ul（或50ug/每室）Matrigel ，混匀，（ 4操作，最好在冰浴上），加入上室各100ul（3个室）；放入37培养箱中，孵育4-5h（5h）；此间经常观察，当出现“白色层”时，说明已经变为固态。注释：无血清培养基和基质胶按1：5稀释，每孔加50ul，在37培养箱中1-2h。（3）消化细胞，无血清培养基洗3次，计数，配成细胞悬液；（4）用无血清培养基洗 Matrigel洗1次；每孔加入100ul细胞悬液；（5）下腔室中加入500ul含有20FBS条件培养基；（6）37培养箱中，孵育20-24h；（7）取出transwell用PBS洗2遍， 5%戊二醛固定，4；（8）加入结晶紫（0.1%）染色或Giemsa染色（510min），室温0.5h，PBS洗2遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察。 迁移实验transwell在24孔板中浸泡1小时；消化细胞，无血清培养基 洗 2 次，计数，配成 细胞悬液，每孔加入100ul细胞悬液；加药刺激；下腔室中加入条件培养基或其他刺激因子；37培养箱中，孵育 20-24h；取出 transwell用 PBS洗2遍，5% 戊二醛固定， 4；PBS洗2遍，加入结晶紫（0.1%）染色，室温0.5h，PBS 洗 2 遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察计数 10 照相，记录。侵袭实验取 300ul 无血清培养基 ，加入 30ul （或 50ug/ 每室） Matrigel ，混匀，（ 4 操作，最好在冰浴上），加入上室各 100ul （ 3 个室）； 放入 37 培养箱中，孵育 4-5h （ 5h ）； 消化细胞，无血清培养基洗 3 次，计数，配成 细胞悬液 ；用无血清培养基洗 Matrigel 洗 1 次；每孔加入 100ul 细胞悬液；下腔室中加入 600ul 无血清 条件培养基；37 培养箱中，孵育 20-24h；取出 transwell 用 PBS 洗 2 遍， 5% 戊二醛固定， 4 ；PBS 洗 2 遍，加入结晶紫（ 0.1% ）染色，室温 0.5h ， PBS 洗 2 遍，用棉球擦去上表面细胞，显微镜下观察 transwell小室是否可以重复利用，该怎样消毒用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水35min，蒸馏水35min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min2，效果很好。