深低温保存血小板制备与质量控制.pptx

单击此处编辑母版标题样式,解放军总医院,由于冰冻保存血小板有良好的临床止血效果和可根据需要长期大量库存的优点，理想的血小板冰冻保存技术研究日益受到关注。血小板是成份输血的重要部分，它对各种原因引起的血小板减少，起到了药物不可替代的治疗作用。血小板的临床止血效果，与所输注的血小板数量和质量关系密切。正确掌握冰冻保存血小板的整个制备过程中的制备技术和质量控制方法，才能提高我们制备的血小板的得率和质量。,简单流程,离心机,冰箱,血小板,全血,ACD,200ml,采血袋,全血,全血,简单流程,血小板,DMSO,-80,冰冻,血小板,血小板,5%DMSO,血小板,37,循环式水浴箱,冰冻,血小板,血小板,DMSO,所需仪器设备,超滤,DMSO,装置,G6,漏斗、电动吸引器,全自动血细胞计数仪,德国,Heraeus,离心机,Cryofuge 8000,或,6000I,超净工作台,血细胞分离机,-80,低温冰箱,38,循环式水浴箱,分浆夹、热合机,24G,头皮针,一次性,10ml,无菌注射器,称量仪、自动加样器,冰冻保护剂,DMSO,准备,G6,漏斗、收集瓶、分装瓶的准备,将,G6,漏斗、收集瓶、分装瓶先用长水冲洗，硫酸,-,高锰酸钾液浸泡,24,小时，流水冲洗后用双蒸水冲洗、浸泡，然后包装，通过高压蒸汽消毒（,136,，,6-8,分钟）。,超滤后,500ml/,瓶分装好避免光，置于洁净环境室温保存。,DMSO,的超滤和保存,在无菌间，超净工作台中，将购置的,DMSO,用,G6,漏斗负压抽滤。,冰冻血小板制备方法,从全血采集到制备血小板的全过程，均要求在,222,环境中,6,小时内完成（包括离心温度）。即使不立即制备，也不要将全血放入冰箱,4,保存，以免影响血小板质量。,冰冻血小板制备方法,冰冻血小板制备方法,新鲜富含血小板血浆（,FPRP,）制备,最佳离心分离条件选择,离心是制备冰冻富含血小板血浆最重要的环节之一。选择最佳离心条件的目的，是为了使获得的富含血小板血浆中血小板浓度较高，而红细胞、白细胞污染少。选择最佳离心条件的方法需要根据各单位的具体条件来确定。,最佳离心条件选择方法,我科采用析因设计确定最佳离心条件。测定,ACD,全血、,FPRP,内血小板计数和,FPRP,体积，计算所得血小板数和血小板得率，确定最佳离心条件。,冰冻血小板制备方法,室温,(18-22,左右,),条件下，用三联采血袋采集健康献血者,ACD-B,抗凝全血,200ml,。要求采血流畅，采血时间,3min,。预实验表明采用德国,Heraeus Cryofuge 8000,和,6000I,离心机，加速度为,9,档，减速度为,4,档的条件下，在,400-650g,离心,5-11min,血小板得率较高。,冰冻血小板制备方法,冰冻血小板制备方法,二因素,离心力,离心时间,400g,480g,560g,650g,5min,7min,9min,11min,四水平,组合成,16,种离心条件,通过计算各条件下血小板得率，同时参考白细胞和红细胞污染率，选取最佳离心条件。,冰冻血小板制备方法,冰冻血小板制备方法,结果,222,条件下，采用德国,Heraeus Cryofuge 8000,离心机，加速度为,9,档，减速度为,4,档，,480g,，离心,7min,条件下，平均得率为,70%,。红细胞污染,110,9,/,单位；白细胞污染,510,7,/,单位。,冰冻血小板制备方法,从,ACD,全血离心制备的,FPRP,质量，不仅与离心机的离心速度有关，而且与血液体积、血球压积、离心机启动加速度和减速度密切相关。其中离心机性能非常重要。,冰冻血小板制备方法,由于离心后,ACD,全血中的红细胞压得不紧，容易因为振摇和非匀速运动而泛起，混入,FPRP,中。共振明显的离心机不适于制备富含血小板血浆。合适的离心机减速度档选择低档较好。,冰冻血小板制备方法,离心时要采取措施如仔细系绑等，防止血袋在离心杯内出现皱折或塌伏，减少分离时红细胞污染。,冰冻血小板制备方法,离心完毕，要轻拿轻放，尽量减少搬动次数。最好将离心好的血液直接从离心杯中轻轻转移到分浆夹中。分离上层,FPRP,应该用止血钳控制速度。速度以慢为好，至少要先快后慢。否则将会减少血小板得率，增加红细胞和白细胞污染。,冰冻血小板制备方法,添加冰冻保护剂,DMSO,二甲基亚砜,在冰冻血小板中作用,冰冻血小板制备方法,二甲基亚砜（,DMSO,）,:,化学试剂、分析纯、分子式：,C2H6OS,、分子量：,78.13,，凝点约,18.3-18.5,、沸点：,189-192,，比重：,1.099-1.109g/ml,为无色稀薄液体、略带苦味，易吸潮、具特殊臭味（大蒜样味）。,冰冻血小板制备方法,本药品口服及皮肤给药均易吸收，皮下注射,4-8,小时，一部分以原形从尿中排泄、还有少部分经肺排出。,冰冻血小板制备方法,DMSO,在冰冻血小板中主要作为一种防冻剂，保护血小板膜。在缓慢加入,DMSO,时，,DMSO,将血小板包围起来，既起到保护作用又可抑制血小板的凝集、聚合作用。,冰冻血小板制备方法,DMSO,有抑菌作用，,DMSO,浓度为,8%,时，能抑制,92%,的绿脓杆菌生长、浓度为,15%,时，能抑制的大肠杆菌和巨大芽胞杆菌生长、但高浓度使用本品不能代替灭菌。,冰冻血小板制备方法,DMSO,使用前要经,G6,漏斗滤除杂物、细菌、热原质等。装放在洁净无菌的玻璃瓶中，室温保存。,DMSO,添加方法,离心后轻轻分离上层新鲜,PRP,（,FPRP,），经过称量，在洁净的环境中采用无菌技术，用一次性,10ml,注射器和,24G,头皮针缓慢（,5min,）加入超滤,DMSO,，终浓度为,5%,。,冰冻血小板制备方法,需要添加,DMSO,量的简单计算方法：,DMSO,（,ml,）,=,富含血小板血浆（,ml,）,0.05,在加入,DMSO,过程中，要用一定强度充分混匀，避免局部产热。盒装后直接放入,-85,冰箱保存。,冰冻血小板制备方法,冰冻血小板制备方法,5%DMSO,在室温下,2-3,小时内对血小板通常无明显毒性作用。加入,5%DMSO,后，血小板激活标志物,CD62p,（,P,选择素）和磷脂酰丝氨酸阳性率稍微增加，这与,DMSO,加入方式有关。,冰冻血小板制备方法,将高浓度的,DMSO,加入,FPRP,中会有局部产热现象，如果加入过快，可使局部温度过高，引起血小板激活。,冰冻血小板制备方法,CD62p,阳性率升高幅度与,DMSO,添加的速度和混合方式密切相关。过快的添加速度和剧烈振荡可以使,CD62p,阳性率明显升高。在,DMSO,加入的过程中，人工添加要求采取正确的振荡方式和合适的添加速度。最好采用机械自动加入和自动摇床，有利于操作标准化和质量控制。,富含血小板血浆质控,检测献血者外周血血小板计数,要求献血者,PLT,15010,9,/L,要求分离后血小板个数,2.010,10,个,/,袋,红细胞污染,110,9,/U,白细胞污染,510,7,/U,每月抽样,5,袋，做血小板，白细胞,红细胞计数，细菌培养，及五项实验 （,ALT,，,HBsAg,，,HCV,，,HIV,，,USR,）,机采浓缩血小板冰冻保存,取机采新鲜浓缩血小板，在洁净的环境中采用无菌技术，用一次性,10ml,注射器和,24G,头皮针往血小板收集袋中，缓慢（,10,分钟）加入超滤,DMSO,，终浓度为,5%,。需要添加,DMSO,量的简单计算方法同上。折叠好，盒装后直接放入,-80,冰箱保存。,冰冻血小板解冻和使用,根据患者需要的治疗剂量，取出相应数量的冰冻,PRP,，置于,38-42,循环式水浴箱快速解冻。,输注方法同液体保存血小板。用输血器尽快输注。,谢 谢！,