实验三叶绿素含量的测定等.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,实验三、,叶绿体色素含量的测定（分光光度法 和,SPAD,叶绿素仪法,）,高等植物在光合反应中吸收光能的主要色素为叶绿素,其含 有的叶绿素,a,和叶绿素,b,能将光能转化为化学能,形成有机物质。因此,叶片中叶绿素含量的高低是反映植物叶片光合能力的一个重要指标。,一、目的,:,了解分光光度计和,SPAD,叶绿素仪,的使用方法；理解分光光度计测定叶绿体色素含量的实验原理；掌握计算叶绿体各色素成分含量的方法。,要求：,2,、问答题：,（,1,）,Lambert-Beer,定律又叫什么定律？列出其数学表达式（并说明各符号的代表意义）。,Lambert-Beer,定律中的比例系数“,K”,的物理意义是,？,Lambert-Beer,定律本身是否有局限性？何谓吸光度的加和性？,（,2,）叶绿素在兰光区的吸收峰高于红光区的吸收峰,为何不用兰光区的光吸收来测定叶绿素的含量？,（,3,）本实验为什么要用光路宽度为,1cm,的比色杯？,二、原理,叶绿素提取液中同时含有叶绿素,a,和叶绿素,b,二者的吸收光谱虽有不同,但又存在着明显的重叠,（如图）,在不,分离叶绿素,a,和叶绿素,b,的情况下同时测,定叶绿素,a,和叶绿素,b,的浓度,可分别测,定在,665nm,和,649nm,的光吸收,由于在,该波长时叶绿素,a,、,b,的比吸收系数,K,为,已知，我们即可以根据,Lambert-Beer,定律,列出浓度,C,与光密度,D,之间的关系,式：,D,665,=83.31Ca+18.60Cb,.(1),D,649,=24.54Ca+44.24Cb,.(2),从而计算出提取液中叶绿素,a,和叶绿素,b,的浓度,.,叶绿素,a,、,b,的比吸收系数,波长,(nm),叶绿素,a,叶绿素,b,665,83.31,18.60,649,24.54,44.24,注：,(1)(2),式中的,D,665,、,D,649,为叶绿素溶液在波长,665nm,和,649nm,时的光密度。叶绿素,a,、,b,的浓度单位为：,g/L,解方程式,(1)(2),，则得：,Ca=13.7 D,665,5.76D,649,(3),Cb=25.8 D,649,7.6 D,665,.(4),G,总,=Ca+Cb=6.10D,665,+20.04D,649,(5),注：,此时，,Ca,、,Cb,为叶绿素,a,、,b,浓度，单位为,:mg/L,，利用上面（,3,）（,4,）,(5),式，即可以计算叶绿素,a,、,b,含量及总叶绿素的总含量,(,G,总,),。,二、材料：,大红花老叶和嫩叶,三、实验步骤,1.,取新鲜大红花叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。,2.,称取剪碎的新鲜样品,0.5g,，放入研钵中，加少量碳酸钙和石英砂及,2,3ml95,乙醇，研成均浆，再加乙醇,10ml,，暗处静置,3,5min,。,3.,取滤纸,1,张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到,25ml,棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。,4.,用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至,25ml,，摇匀。,5.,把叶绿体色素提取液,稀释,5,倍,后倒入,光径,1cm,的比色杯内。以,95,乙醇为参比，在波长,665nm,、,649nm,下测定光密度。,四、实验结果计算,将测定得到的吸光值代入下面的式子：,Ca=13.7 D,665,5.76D,649,(3),Cb=25.8 D,649,7.6 D,665,.(4),G,总,=Ca+Cb=6.10D,665,+20.04D,649,(5),分别计算叶绿素,a,、,b,和总叶绿素的含量,Chl,（,mg/g.FW,）,=,原理：,SPAD-502,叶绿素仪通过测量叶片在两种波长光学浓度差方式,650nm,和,940nm,来确定叶片当前叶绿素的相对数量。,测量值是通过对在二个不同波长区域，叶片传输光的数量进行计算，在这二个区域叶绿素对光吸收不相同的。这二个区域是红光区,(,对光有较高的吸收且不受胡萝卜素影响,),和红外线区,(,对光的吸收极低,),开机,调零,测量,1,测量,2,测量,3,求平均值,一 分光光度计的工作原理：,分光光度计采用一个可以产生,多个波长,的,光源,，通过系列分光装置，从而产生,特定波长,的,光源,，,光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。,样品的,吸光值,与,样品的浓度,成,正比,。,二 分光光度计的基本常识：,1,、紫外光分光光度计，其使用,波长在,190,400nm,可见光分光光度计，其使用,波长在,400,800nm,。,2,消光系数：,是溶液对光吸收的比例常数，指在一定的浓度和波长等条件下物质的光吸收值，用,K,表示。它取决于溶质性质、入射光波长和温度。,消光度,（也叫光密度,OD,，或吸光值,A,）：表示溶液吸收光的强弱或吸收程度，也用,E,表示。,E,值愈大，溶液对光吸收的程度愈大。,透光率（,用,T,表示）,：,是透射光强度（透过比色皿）与入射射光强度（还未过比色皿之前的光强度）之比（用,T=I,t,/I,0,表示）,。,三、分光光度计的基本维护及使用注意事项：,1,分光光度计必须放置在固定且不受震动的仪器台上，不能随意搬动。严防震动、潮湿和强光直射。,2,分光光度计内放有硅胶干燥袋应定期更换。,3,仪器连续使用时间不应超过,2,小时，,每次使用需歇半小时以上才能再用。用完仪器后，务必关避电源开关，拔下插头。清理仪器上的杂物（包括灰尘、水啧、溶液等）。,4,千万不可用手、滤纸、毛刷等物摩擦,比色杯的光滑面,。,不允许用酒精、汽油、乙醚等有机溶液擦洗仪器。,5,盛待液时，必须达到比色杯的,2/3,左右，不宜过多。用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。,6,每套分光光度计上的比色杯及比色槽不得随意更换。,7,测定某未知待测液时，先制作该溶液的吸收光谱曲线，,再选择,最大峰的波长作为测定的波长,。一般所制成的溶液应,尽量使光密值在,0.1,0.7,的范围内,测定。,VIS-723N,可见分光光度计,比色皿校正和多波长测定,操作步骤：,1.,在主菜单下选择“,2,光度测量”,主菜单,1,波长扫描,2,光度测量,3,定量分析,4,时间扫描,5,实时测量,6,系统设置,3.,比色皿配对完成后，按“,RETURN”,键退回光度测量参数设置界面。,4.,按,F2,开始测量。可按照屏幕上的提示进行测量操作，当有多个样品需要测量时，可测完一个后再按“,F2”,测下一个。注意样品的编号,N,值必须和比色皿的编号一致。,2.,按“,F1”,进行比色皿的校正，输入除参比杯外的比色杯个数后按“,ENTER”,键，再按“,F2”,，根据仪器提示进行操作即可。,AM-300,手持式叶面积仪测定叶面积,原理：,内置固体标准光源的,CCD,扫描系,统,开机,按住电源开关,1,秒,选择显示方向,放入材料（不能直接接触探头）,按住探头上红色,button,直至发出两种连续蜂鸣,屏幕提示“,measure”,可开始测量,探头从材料上方匀速滑过，等屏幕显示出完整叶片形状后再次按红色,button,结束测量,植物叶面积的测定（画纸称重法）,将所测叶片放在厚度均匀的称量纸上，用铅笔将叶形画好，剪下所画的纸叶，在电子天平上称重，记为,W,1,；另取,10*10cm,2,的纸片，称重记为,W,2,；则所测叶片面积,X,可按下面公式计算出。,X,（,cm,2,）,W,1,/W,2,100,CB-1102,便携式光合蒸腾测定仪,特点：,非破坏性测量，即不离体测量,具有开路和闭路测量两种光合测量方式,可以手动或自动测量，可编程自动定时测量,全部测量参数和计算结果可以存贮，并通过,RS232,接口传输到计算机,原理：,利用红外,CO,2,分析器和湿度传感器对参考气和流经叶室后的测量气进行测量，根据,CO,2,浓度差和湿度差以及流量等参数，利用气体通量公式，分别计算净光合（或呼吸）速率和蒸腾速率。,仪器中使用的参数：,a,温度,CO,2,i,室内,CO,2,浓度,CO,2,o,室外,CO,2,浓度,RHi,室内相对含水量,RHo,室外相对含水量,PA,光合有效辐照度,净光合速率,蒸腾速率,CO,2int,胞间,CO,2,浓度,