靶向四链体DNAs邻菲罗啉衍生物的设计合成及生物活性研究.doc

靶向四链体DNAs邻菲罗啉衍生物的设计合成及生物活性研究
【摘要】：本论文设计合成了6个全新的1.10-邻菲罗啉衍生物(1-6)。利用生物物理和生物化学方法系统研究了化合物1-4与人端粒G-四链体和i-motifDNAs以及启动子c-kit2和c-mycG-四链体DNAs的相互作用,测试了它们对端粒酶活性、启动子转录活性、癌细胞以及细胞周期的影响。主要结果如下：1、设计合成了6个全新的以1,10-邻菲罗啉为主体的衍生物(1-6),并用红外光谱、1HNMR、13CNMR、ESI-MS及元素分析等方法对其进行了结构表征。2、CD光谱表明,化合物1-4能诱导人端粒序列DNA(HTG21)从无序折叠或杂交G-四链体结构转变成反平行G-四链体结构。进一步结合FRET-熔点实验及PCRstop分析发现,在25倍摩尔当量双螺旋DNA(ds26)存在下这些化合物能选择性识别并稳定反平行G-四链体DNA。TRAP分析表明化合物1-3在2μM时几乎完全抑制了端粒酶活性。3、利用JobPlot、紫外可见吸收光谱和竞争透析法和等研究了化合物1-3对人端粒G-四链体和i-motifDNAs的亲和性及键合计量比。结果表明这些化合物对G-四链体和i-motifDNAs的键合计量比分别为2：1和1：1。结果表明化合物1-3对上述四链体DNAs的亲和能力大于ctDNA。UV-熔点实验表明化合物1-3使i-motifDNA的熔点温度升高7.2-10.1℃。热力学参数(AG,ΔH和ΔS)表明,化合物1-3与四链体以及双螺旋DNAs的键合都是熵驱动的过程。4、利用CD光谱、PCRstop分析、FRET-熔点实验、紫外可见吸收光谱和FID方法研究了化合物1-3对致癌基因启动子c-myc和c-kit2G-四链体DNAs构象的影响、稳定作用、亲和能力。CD光谱表明,化合物1-3的键合略微扰动c-kit2G-四链体的构象,而对c-myc的构象没有显著的影响。化合物1-3能中等程度地稳定c-myc及c-kit2G-四链体DNAs,而且比双螺旋DNA具有更高的键合选择性。三个化合物对c-kit2的稳定作用大于c-myc,但是对c-myc有更高的亲和能力。另外,实时荧光定量RT-PCR结果表明,化合物1能下调HepG2癌细胞中c-kit2和c-myc基因的转录水平。5、MTT分析表明,化合物1-4都可以抑制HeLa和HepG2细胞的增殖。与癌细胞孵育72h,化合物1-3对HeLa细胞的IC50值大约为2μM,化合物1-4对HepG2细胞的IC50值为0.5-4.4μM；对HepG2细胞长期毒性实验表明,化合物1-3对癌细胞增殖抑制具有一定的时间依赖性。流式细胞术买验结果表明,化合物1-3将HeLa细胞周期阻滞在Go/G1期；而这些化合物处理HepG2后,G0/G1期细胞数量略微减少。【关键词】：G-四链体邻菲罗啉端粒酶致癌基因启动子癌症
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：TQ463;R96
【目录】：创新之处14-15中文摘要15-17ABSTRACT17-19第—章综述19-611.1引言191.2四链体DNAs19-301.2.1G-四链体DNAs的结构及生物学功能21-291.2.1.1G-四链体DNAs的结构21-251.2.1.1.1人端粒G-四链体DNAs的结构21-221.2.1.1.2癌基因启动子c-kit2和c-mycG-四链体DNAs的结构22-251.2.1.2G-四链体DNAs的生物学功能25-291.2.1.2.1人端粒G-四链体DNA与端粒、端粒酶及癌症的关系25-281.2.1.2.2原癌基因启动子c-kit2和c-mycG-四链体DNAs的功能28-291.2.2I-MotifDNA的结构及功能29-301.2.2.1I-motifDNA的结构29-301.2.2.2I-motifDNA的功能301.3G-四链体DNAs靶向分子的研究进展30-371.3.1有机小分子化合物与G-四链体DNAs的作用模式31-331.3.2靶向G-四链体DNAs的有机小分子化合物33-371.3.2.1氟代喹诺酮类化合物33-341.3.2.2端粒抑素类化合物34-351.3.2.3吖啶类小分子配体35-361.3.2.4卟啉类化合物36-371.3.2.5AS1411371.4四链体DNAs与小分子配体相互作用的研究方法37-471.4.1研究键合亲和性及构象的方法38-421.4.1.1紫外可见吸收光谱38-391.4.1.2圆二色光谱39-401.4.1.3荧光光谱40-421.4.2研究结构参数的方法42-431.4.2.1X-Ray晶体衍射421.4.2.2核磁共振波谱42-431.4.2.3分子模拟431.4.2.4电喷雾离子质谱431.4.3研究动力学和热力学参数的方法43-451.4.3.1等温滴定量热法441.4.3.2表面等离子体共振44-451.4.4生物学方法45-471.4.4.1聚合酶链反应终止分析461.4.4.2实时荧光定量RT-PCR46-471.4.4.3MTT分析471.4.4.4流式细胞术471.5设计思路和主要研究内容47-49参考文献49-61第二章邻菲罗啉衍生物的合成和结构表征61-712.1引言612.2实验试剂及仪器61-632.2.1实验试剂61-622.2.2实验仪器62-632.3邻菲罗啉衍生物的合成及结构表征63-682.3.1邻菲罗啉衍生物系列Ⅰ(1-4)的合成及结构表征63-672.3.2邻菲罗啉衍生物系列Ⅱ(5,6)的合成及结构表征67-682.3.3水溶液中化合物1-6的稳定性682.4本章小结68-69参考文献6971第三章邻菲罗啉衍生物对人端粒四链体DNA的稳定及端粒酶抑制活性研究71-913.1引言713.2实验材料及仪器71-733.2.1实验材料71-733.2.2实验仪器733.3实验方法73-773.3.1溶液的配制73-743.3.2CD光谱74-753.3.3FRET-熔点实验753.3.4UV-熔点实验753.3.5PCRstop实验75-763.3.6端粒重复扩增分析实验76-773.3.6.1细胞培养763.3.6.2细胞裂解及端粒酶提取763.3.6.3端粒重复扩增分析76-773.4结果和讨论77-853.4.1邻菲罗啉衍生物对人端粒G-四链体及i-motifDNAs构象的影响77-783.4.2邻菲罗啉衍生物对人端粒G-四链体和i-motifDNAs的稳定性影响78-833.4.3邻菲罗啉衍生物对无细胞体系下端粒酶活性的抑制83-853.5本章小结85-86参考文献86-91第四章邻菲罗啉衍生物与人端粒四链体及双螺旋DNAs的键合作用研究91-1034.1引言914.2实验部分914.3实验方法91-934.3.1紫外-可见吸收滴定91-924.3.2荧光滴定924.3.3连续变化分析92-934.3.4竞争透析实验934.4结果和讨论93-994.4.1双螺旋键合研究93-954.4.1.1紫外-可见吸收滴定和热力学参数93-954.4.1.2荧光光谱954.4.2四链体DNAs键合研究95-994.4.2.1紫外-可见吸收滴定和热力学参数95-974.4.2.2荧光光谱97-984.4.2.3连续变化分析98-994.4.2.4竞争透析实验994.5本章小结99-100参考文献100-103第五章邻菲罗啉衍生物与启动子G-四链体DNAs的相互作用及转录活性影响103-1255.1引言1035.2实验材料及仪器103-1055.2.1实验材料103-1055.2.2实验仪器1055.3实验方法105-1075.3.1PCRstop分析1055.3.2FRET-熔点实验1055.3.3荧光指示剂置换实验1055.3.4紫外-可见吸收滴定1055.3.5荧光滴定105-1065.3.6CD光谱1065.3.7荧光定量RT-PCR对启动子c-kit2及c-myc转录活性的影响106-1075.3.7.1细胞培养1065.3.7.2裂解细胞1065.3.7.3提取总RNA106-1075.3.7.4反转录反应1075.3.7.5RealtimeRT-PCR1075.4结果和讨论107-1185.4.1化合物对G-四链体DNAs的稳定作用107-1105.4.2化合物对于G-四链体和双螺旋DNAs的键合亲和性110-1135.4.3化合物对G-四链体DNAs构象的影响113-1145.4.4化合物对癌细胞中c-kit2和c-myc基因转录活性的影响114-1185.5本章小结118-119参考文献119-125第六章邻菲罗啉衍生物对癌细胞增殖和细胞周期的影响125-1356.1引言125-1266.2实验试剂和仪器126-1276.2.1实验试剂126-1276.2.2实验仪器1276.3实验方法127-1286.3.1细胞培养1276.3.2MTT分析127-1286.3.3流式细胞分析1286.4结果与讨论128-1326.4.1化合物对HeLa和HepG2细胞增殖的影响128-1316.4.2化合物物对癌细胞细胞周期的影响131-1326.5本章小结132-134参考文献134-135第七章总结与展望135-1397.1总结135-1377.2展望137-139附录Ⅰ缩略语表139-141附录Ⅱ附图141-157附录Ⅲ攻读博士学位期间发表和待发表的论文157-158致谢158-159个人简况及联系方式159-161 本论文购买请联系页眉网站。