口腔咽拭子基因组DNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书.doc

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◆ TRIpure Reagent 抽提指南
◆ 目录号 RP02
◆ 使用手册
◆ 实验室使用，仅用于体外
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口腔/咽拭子基因组DNA快速提取试剂盒
目录号：DN30
目录编号
包装单位
DN3001
50次

v 适用范围：
适合于从口腔/咽拭子中分离纯化基因组DNA。

v 试剂盒组成、储存、稳定性：
试剂盒组成
保存
50次
裂解液ML
室温
20 ml
结合液CB
室温
20 ml
抑制物去除液IR
室温
25 ml
漂洗液WB
室温
15ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
Poly Carrier
-20℃
200μl
洗脱缓冲液EB
室温
15 ml
蛋白酶K粉（可选）
20mg/ml
-20℃
20 mg
吸附柱AC和收集管
室温
50套
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果
储存事项：
1. 结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2. 为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解。因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存，－20℃保存。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
v 产品介绍：
本试剂盒采用特制的进口DNA吸附柱和独特的缓冲液系统，特别适合于从口腔/咽拭子中分离纯化基因组DNA。各种来源样品裂解消化处理后DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜（特别配备了Poly Carrier可以从体系中轻松捕获微量核酸），再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净的基因组DNA从硅基质膜上洗脱。纯化后的DNA无杂质和PCR抑制剂，可直接适用于PCR分析。典型产量0.5μg-3.5μg/拭子。
v 产品特点：
1. 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
2. 节省时间，简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成。
3. 配备了Poly Carrier 用于充分收集特别微量DNA。
4. 多次柱漂洗确保高纯度，提取的DNA 纯度高，质量稳定可靠，可适用于各种常规操作，包括PCR、酶切、测序、Southern 杂交等。
v 注意事项：
1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2. 开始实验前将需要的水浴先预热到特定温度备用。
3. 结合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4. Poly Carrier：
Poly Carrier 使用方法：如果起始处理量很少（口腔咽拭子上收集到的细胞很少），我们推荐使用Poly Carrier，如果预期有较大量DNA产量，用户可以根据需要选择是否加入PolyCarrier。使用时在每个样品提取所需400μl结合液CB 中加入4μl Poly Carrier，将结合液CB 与Poly Carrier溶液充分颠倒混匀即可(结合液CB容易起泡沫,请勿使用涡旋振荡混匀)。也可根据样品数量，在总共需要的结合液CB中加入总共需要的Poly Carrier混匀备用。混合液在室温24小时内稳定。
v 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
提示：第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
取样：取一根医用消毒棉签（手不要碰触脱脂棉部位），伸进口腔，紧靠脸颊内侧来回刮拭20次（不时旋转棉棒），需充分接触口腔粘膜。
注意事项：避免用手触及棉签，采集前可先用清水轻轻漱口。为防止样本被食物或者饮料污染，取样前30分钟内应该避免进食或者饮水。
1. 用剪刀将棉签部分从其杆上剪下，放入2ml 离心管中，加入400μl裂解液ML。
2. 再加入20μl的蛋白酶K (20mg/ml)溶液，立刻涡旋振荡充分混匀，
3. 可选步骤（一般不需要做）：56℃放置1小时，期间每10分钟涡旋混匀10秒。
一般情况下该步骤可以省略，除非效果不好，再尝试加做此步骤 。
4. 加入400μl结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，70℃放置10分钟。此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴，然后挤压去除拭子，将尽可能多的裂解液转移至新的离心管。
棉签的棉花可能还吸附一些液体，如果要提高产量，可以用干净镊子夹挤出液体后弃棉花，减少棉花上液体残留。
如果拭子上细胞数量少，导致提取的基因组DNA产量过低于1μg, 可以在400μl结合液CB 中加入4μl Poly Carrier 。
5. 冷却后加200μl 无水乙醇，立刻涡旋振荡充分混匀。简短离心以除去管盖内壁的液滴，收集所有的液体到管底。
如果周围环境高于25℃,乙醇需要冰上预冷后再加入。
6. 将上一步混合物加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液。
7. 加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 离心30秒，弃废液。
8. 加入500μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
9. 加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。
10. 将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
11. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加20－50μl洗脱缓冲液EB （洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好）， 室温放置1分钟，12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于20μl，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
12. DNA可以短暂存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃。
v 问题与解决方法
问题
评论与建议
DNA产量低或者洗脱液中无DNA
* Poly Carrier没有加入到结合液CB-建议：仔细阅读注意事项4。
*样品冻融超过1次-建议：尽量使用新鲜样品和冻融不超过1次的样品。
*样品在室温放置过久-建议：尽快处理样品或者低温适当方式保存。
*裂解不完全，蛋白酶K失效了-建议：收到蛋白酶K后，按照每次使用量分装冻存，避免反复冻融。
*结合液CB和Poly Carrier没有充分混匀-建议：充分涡旋混匀。
*试剂和样品没有充分混匀-建议：加入每个试剂后都要充分混匀。
*洗脱效率不高-建议：确保做了步骤9，否则残留乙醇会影响洗脱效率，仔细阅读步骤13和只使用洗脱缓冲液EB洗脱。
DNA的下游反应如PCR效果不佳
* DNA产量低或者洗脱液中无DNA-建议：在下游反应中增加DNA用量。
* 降低的灵敏度-建议：确定在下游PCR应用中DNA洗脱液的最大允许用量，减少或者增加DNA洗脱液在PCR反应中的用量，DNA洗脱体积也可以相应的调整。

DNA下游酶切
不能切开或者
酶切不完全
* 离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇抑制了酶切反应-建议：确保做了步骤10，然后空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。
* 一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反应-建议：将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟，小心取上清使用。

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