单克隆抗体和基因工程抗体的制备优秀课件优质文档.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单克隆抗体和基因工程抗体的制备,第四章 单克隆抗体与基因,工程抗体的制备技术,李闻文 2021,10,中南大学湘雅医学院检验系,临床微生物学免疫学教研室,目的要求,1.,掌握杂交瘤技术的基本原理,2.,熟悉单克隆抗体的制备技术,3.,熟悉基因工程抗体技术,大多数抗原分子具有多个抗原决定簇（表位，,epitope,）。一个抗原决定簇刺激一个,B,细胞克隆产生一种特异性抗体，一种抗原刺激机体产生多种抗体称为多克隆抗体（,polyclonal antibody,PcAb,）如免疫血清。由一个只识别一种抗原表位的,B,细胞克隆产生的同源抗体称为单克隆抗体,(monoclonal antibody,McAb),。,概 述,单克隆抗体理化性状高度均一，其抗原结合部位完全相同，生物活性专一，特异性强，纯度高，效价高，易于实验标准化及大量制备，是研究抗体的一重大突破。应用比较广，如试剂诊断盒、治疗肿瘤、器官移植及自身免疫病等。,第一节 杂交瘤技术的基本原理,基本原理是融合的两种细胞保持自身的特性，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞称为杂交细胞。包括,B,细胞、,T,细胞，前者产生,Ig,，后者产生,CK,。,一、,B,淋巴细胞杂交瘤技术,细胞是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。,B,细胞能产生抗体，但不能在体外长期生长，而骨髓瘤细胞不产生抗体但在体外能长期生长，二者融合，各保持其本性，既产生抗体又长期生长。,其原理分为几个步骤,目的是制备抗原特异的,McAb,，所以融合的细胞必须经抗原免疫的,B,细胞，通常取脾，另一是在体外长期生长又不产生抗体，所以选肿瘤细胞即多发性骨髓瘤细胞，具备以下特点：,（一）细胞的选择与融合,1.,稳定、易培养,2.,自身不分泌,Ig,或,CK,3.,融合率高,4.,是,HGPRT,缺陷株,目前常用的,BALB/c,小鼠,B,细胞瘤株有,P3-X63-Ag8.653C,（,P3.653,）、,Sp2,/,0,等。为,HAT,敏感株，易培养,融合率高，最常选用聚乙二醇,(PEG),使细胞膜轻度损伤，细胞容易融合。,（二）选择培养基的应用,细胞融合是一个随机的物理过程。融合后可能出现以下情况,:,1,）脾细胞与瘤细胞,2,）瘤细胞与瘤细胞,3,）脾细胞与脾细胞,4,）未融合的脾细胞,5,）未融合的瘤细胞,6,）多聚体形式。,3,）、,4,）、,6,）在体外易死去，不需筛选。,细胞的,DNA,合成一般有两条途径,一是糖和氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，进一步合成,DNA,，叶酸是重要辅酶。,一是辅助途径，是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶存在下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（,hypoxanthine guanine phospheribosyl transferase,HGPRT,）和胸腺嘧啶核苷激酶（,thymidine kinase,TK,）的催化作用,合成,DNA,。,氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，当氨基蝶呤存在时，能阻断第一条途径。细胞融合的选择培养基中有三种关键成分，次黄嘌呤,(hypoxanthine,H),、氨基蝶呤,(aminopoterin,A),、胸腺嘧啶核苷,(thymidine,T),，三者取前缀缩写为,HAT,培养基，其融合细胞所用的瘤细胞是经毒性培养基选择出来的,HGPRT,阴性细胞株。,所以，前面提到的,2,）瘤细胞与瘤细胞及,5),未融合的瘤细胞不能生长，只有,1,）脾细胞与瘤细胞才能生长，因为脾细胞为,HGPRT,阳性，通过补偿途径代替氨基蝶呤阻断的主要途径。,（三）有限稀释与抗原特异性选择,在免疫动物时，一种抗原往往有多个表位，一个,B,细胞克隆接受一个表位，故在免疫动物时是众多,B,细胞克隆的抗体的分泌，而针对目的抗原的,B,细胞只占很少部分，在细胞融合后，有相当一部分是无关的细胞融合体，即融合细胞分泌的不是目的抗体，要进行筛选，分二步稀释。,计数，每个孔只放一个细胞，实际是,0,至数个，整个过程为克隆化，将阳性细胞株重复一次，尽量使抗体更纯，将阳性细胞进行增殖，部分冻存，部分进行体外培养或动物接种。,另外还有其他杂交瘤技术，如人,-,人,B,淋巴细胞杂交瘤和鼠,-,人,B,淋巴细胞杂交瘤，人骨髓瘤细胞系体外建株比较困难，生长不稳定，有的分泌,IgE,，有的分泌,Ig,的,、,链。,B,细胞取外周血淋巴细胞、脾细胞、淋巴结细胞、病灶浸润性淋巴细胞。从理论上讲很好，但实际比较困难，在于缺乏好的亲体骨髓瘤细胞株，较难获得抗原特异性,B,淋巴细胞；人杂交瘤细胞不能在小鼠或其他动物体内生长。,小鼠骨髓瘤与人的,B,细胞杂交瘤，该技术优点是易获得小鼠骨髓瘤细胞，融合率较高，但最大的缺点是不同种杂交后不稳定，杂交瘤传代后，很快丧失分泌抗体的染色体。,二、,T,细胞杂交瘤,自,B,细胞杂交瘤技术后，,T,淋巴细胞杂交瘤成为热门，为获得淋巴因子，更深入地研究,T,细胞的各种功能，虽然有一些小鼠,T,细胞杂交瘤成功的报道，但结果不满意，该细胞很不稳定，分泌淋巴因子无特异性，一种,T,细胞杂交瘤可同时分泌几种淋巴因子，到目前仍无突破性进展。,T,淋巴细胞杂交瘤分为小鼠及人，由于,T,细胞功能的多样化，制备出的,T,细胞杂交瘤也各有其特性，如分泌淋巴因子，特异性杀伤功能，分泌抑制因子，自身反应性等。其基本过程是将激活的,T,细胞与酶缺陷型,T,淋巴细胞瘤细胞融合，可表达特异性,TCR,或其他功能的杂交瘤,T,细胞，与,B,细胞相以，但细胞激活和阳性克隆筛选较为杂交，不稳定，简介主要步骤。,1.,淋巴瘤细胞系的选择,1,）体外无限制快速生长,2,）融合率高,3,）不分泌淋巴因子和杀伤功能,4,）缺乏某一特异性表面抗原或受体,5,）,HGPRT,酶缺陷型,2.,特异性,T,细胞的制备与纯化主要有可溶性抗原诱导激活的,T,细胞、同种反应性,T,细胞、人的特异性,T,细胞。,3.T,细胞杂交瘤的筛选,通常在含有,HAT,选择培养基上，用特异性抗体筛选产生淋巴因子的杂交瘤细胞，用抗,CD3-TCR,抗体筛选阳性细胞。,三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养,杂交瘤细胞形成的初期很不稳定，鼠的二倍体细胞有,40,对染色体，杂交后,80,对，易丢失，丢失后仍生长，要检测上清液中是否有目的抗体及淋巴因子。,将阳性细胞进行单细胞培养，反复,2,3,次，确保为一单细胞阳性杂交瘤细胞应及时冻存，以防止细胞染色体丢失，发生变异或污染，冻存于液氮（,-196,）,冻存时加小牛血清至,20%,加几滴,10%,二甲亚砜。,杂交瘤细胞培养可用液体、半固体、接种动物腹腔。,第二节 单克隆抗体的制备技术,McAb,单一、特异、纯化，利用杂交瘤技术制备,McAb,的基本原理是三个原则：,1,）一种单克隆产生一种抗体,2,）杂交瘤细胞保持双亲细胞特性,3,）筛选培养基,一、单克隆抗体的产生,1.,动物体内生长,杂交瘤细胞注射同系小鼠腹腔，先注射石蜡或不完全佐剂，使腹腔渗出液增多，,1,2,周后无菌方法抽取腹水，离心取上清。,噬菌体显示 指将蛋白分子或肽段基因克隆到丝状噬菌体的基因组 DNA 中，使噬菌体表面表达该异源性分子，主要特点是在同一病毒颗粒内将特定分子的基因型和表型统一，在噬菌体表面表达特定蛋白，在该噬菌体核心DNA中含有该蛋白的基因。,一是糖和氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，进一步合成 DNA，叶酸是重要辅酶。,另有高密度培养，在单位体积内增加细胞的培养数量。,3.,一、B 淋巴细胞杂交瘤技术,如抗体 CD3 和抗 IL-2R的Fab 在体外直接介导T细胞对表达 IL-2的细胞有杀伤作用。,五、抗体库技术及其应用,2）引入半胱氨酸残基，使VH和VL之间形成二硫键；,如将抗体的可变区基因与TCR的链和链恒定区融合，将融合基因导入T细胞，既表达特异性抗体，又表达TCR，该TCR不受MHC分子限制。,熟悉基因工程抗体技术,B细胞能产生抗体，但不能在体外长期生长，而骨髓瘤细胞不产生抗体但在体外能长期生长，二者融合，各保持其本性，既产生抗体又长期生长。,2.,细胞是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。,重组技术将轻链基因和 Fd 随重组于一个表达载体中，即形成组合抗体库。,杂交瘤细胞培养可用液体、半固体、接种动物腹腔。,（二）噬菌体抗体库技术,单克隆抗体和基因工程抗体的制备,2.,体外培养,较常做，用普通培养瓶培养，根据培养时间、细胞生长情况收取上清液。另有高密度培养，在单位体积内增加细胞的培养数量。,二、单克隆抗体的纯化,腹水或细胞上清液，均含有脂蛋白、脂质及细胞碎片等杂质，用滤纸去掉脂质和大颗粒，离心去除细胞碎片和蛋白聚合物。,目前纯化方法有十几种，一般采用盐析、凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取等，现在最有效的方法是亲和纯化法，常用,SPA,或抗小鼠免疫球蛋白抗体与载体交联。称为,Sepharose,柱，抗体结合上去，然后洗脱。,三、单克隆抗体的性质鉴定,鉴定的方法很多，用已知抗原测定抗体，几乎所有的抗原抗体反应试验都可以作，如阳性，再定量，确定工作浓度。,第三节 基因工程抗体技术,杂交瘤单克隆抗体在诊断、治疗、预防和蛋白质提纯应用中非常广泛，但对人是异源性，人抗小鼠抗体，应用基因工程技术减少小鼠源成分，保留原有的抗体特异性。,一、人源化抗体,人源化抗体主要指鼠源性单克隆抗体的基因克隆及,DNA,重组技术改造，重新表达的抗体。其大部分氨基酸序列为人源序列所取代，既基本保留亲代鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了鼠异源性。,（一）人,-,鼠嵌合抗体,通过基因工程技术将人,IgG C,区与,鼠,IgG V,区连接，导入细胞内表达制备的抗体称为嵌合抗体，因,IgG,的抗原性在,C,区，来自人，故抗原性降低，且半衰期明显延长，在介导,CDC,及,ADCC,亦明显增强。,1.,鼠单克隆抗体可变区基因克隆,用探针从该杂交瘤细胞的基因组文库中调取。用,PCR,方法从该细胞的,RNA,中扩增,V,H,及,V,L,基因。,2.,表达载体的构建,人,-,鼠嵌合抗体的表达载体基因依可变区基因克隆的表达方式不同而分为两类，从基因文库所克隆的可变区基因带有上游的转录调控组件及内含子剪接信号，因此载体只需要包括细胞内增殖所必须的抗生素抗性基因和质粒复制的起始序列以及在真核细胞进行选择的显性标记基因。,将载体,DNA,导入真核细胞称为转染。导入的,DNA,整合至细胞基因组,DNA,中得到转染子，要得到稳定的转染子需利用真核细胞的显性选择标记基因，这些标记基因使细胞获得对某些细胞毒物质的抗体，在培养液中加入相应的细胞毒物质可杀死转染不成功的细胞，达到选择的目的。,3.,表达,用哺乳动物细胞或大肠杆菌表达量较少，而应用二氢叶酸还原酶（,dhfr,）扩增系统使抗体表达增强。,dhfr,是正常核酸代谢必须的酶，缺乏该酶的中华仓鼠卵细胞（,CHO,）需在有次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷条件下利用,DNA,合成，因此,dhfr,作,CHO,的显性选择标记基因，在无次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷的情况下，只有导入,dhfr,基因，细胞才能存活。该糸统可用来扩增导入的目的基因。,(,二,),改形抗体（,reshaped antibody,RAB,）,应用基因工程技术在嵌合抗体基础上用人抗体可变区序列取代鼠源单抗,CDR,以外的骨架序列，重新构成既有鼠源单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体，该抗体对人无免疫原性。,（三）抗体的表面修饰,人和鼠,IgV,区来自不同的种属，轻链不同型别，互补性决定区,(complementarity determining region,CDR),的长度可不一致，但暴露于表面的,AA,残基的位置数量都很保守，通过改变表面残基使其人源化，降低鼠可变区的异源性，将,Fv,的表面人源化，消除其免疫原性而不影响,Fv,的整体空间构象。,（四）双特异性抗体,双特异性抗体（,bispecific antibody,BsAb,）又称双功能抗体。两个抗原结合部位具有不同的特异性，可以同时与两种不同特异性抗原发生结合。,1.,化学交联,BsAb,分别分离纯化两种抗原的单抗，先使,Ig,解离后，获得单价抗体，再使两种不同抗原特异性的单价抗体或其片段交联起来。该方法易致抗体失活，其产物也难以保证均质性。,2.,细胞工程,BsAb,将二种杂交瘤细胞进行融合产生杂交瘤，核酸随机组合多种多样。,3.,基因工程,BsAb,用抗体分子片段如,ScFv,或,Fab,等，经基因操作修饰后，或体外组装成为,BsAb,，或直接导入受体细胞表达分泌,BsAb,。,在免疫检测、肿瘤放射免疫显象、药物刹伤、介导细胞刹伤效应起重要作用。,二、小分子抗体,具有结合抗原功能的分子片段称为小分子抗体。其优点：,1,）可在原核细胞表达，生产成本低,;2,）易于穿透血管或组织到靶细胞部位，有利于疾病的治疗；,3,）不含,Fc,段，副作用小；,4,）半衰期短，有利于毒素中和及清除。,小分子抗体包括：抗原结合片段（fragment of antigen binding,Fab,），可变区片段（,fragment of variable region,Fv,）,单链抗体（,single chain Fv,ScFv,），单区抗体。另有,V,H,和,V,L,。,1.Fab,由一条完整的,L,链和约为,1/2,的,H,链组成，是完整抗体的,1/3,，只有一个,Ag,结合位点，它是将,McAb,重链,V,区和,C,H,1,区,cDNA,与完整轻链,cDNA,连接，在细胞启动子的控制下分泌表达。,2.Fv,和单链抗体（,ScFv,）,Fv,由,V,H,和,V,L,构成，非共价键结合，为完整抗体的,1/6,，单一抗原结合位点，,V,H,和,V,L,连接有三种方法：,1,）用戊二醛处理，使之交联；,2,）引入半胱氨酸残基，使,V,H,和,V,L,之间形成二硫键；,3,）把,V,H,和,V,L,用一段适当的寡核苷酸分子连接起来，表达成一个单链，称为,ScFv,。,3.,单区抗体及最小识别单位,根据抗体分子的结构，一般将,Fv,称为抗体的最小单位，但有些更小亚单位仍结合抗原，如单独重链,V,H,仍可保留相当程度抗原结合能力，其作用比,V,L,大，称为单区抗体（,single domain antibody,），其亲和力低于完整的,Fv,，因单区抗体的疏水区的暴露，增加了非特异性吸附，水溶性减低，其应用受到限制但分子量小，单位体积浓度高，副作用小，是很有前景的抗体部分。,将抗体分子片段与其他蛋白融合，可得到有多样性生物功能的融合蛋白，有几种构建方式：,1,）将,Fab,或,ScFv,与其他生物活性蛋白融合，建成生物导弹。,三、抗体融合蛋白,2,）在融合时可根据某些恒定区，可使某些生物活性与抗体的生物学效应功能联结在一起。,3,）将,ScFv,与某些细胞膜蛋白融合，形成嵌合受体，使细胞结合抗原。,（一）含,Fv,片段的抗体融合蛋白,将,Fv,与某些毒素、酶及细胞因子等的基因连接，能编码,Fv,与毒素、酶及细胞因子复合物，即生物导弹，主要在于抗肿瘤。,（二）嵌合受体,将,ScFv,与某些细胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白可表达于细胞表面。其抗体部分与相应抗原特异性结合。如将抗体的可变区基因与,TCR,的,链和,链恒定区融合，将融合基因导入,T,细胞，既表达特异性抗体，又表达,TCR,，该,TCR,不受,MHC,分子限制。,（三）含,Fc,的抗体融合蛋白,如将,CD4,分子细胞膜外部分与,Fc,融合后用真核细胞表达，由二硫键连接成双体，分泌到细胞外，产生二种功能：,1,）延长在血循环中的半衰期；,2,）通过功能蛋白与配体分子的作用，将,Fc,的生物学效应引导至特定目的，如,CD4,与,Fc,融合蛋白，,CD4,是,T,辅助细胞表面糖蛋白，是,HIV,的受体，该融合蛋白能竞争结合,HIV,，可阻断,HIV,对,T,H,的感染，可介导,ADCC,及,CDC,，可通过胎盘。,小分子抗体都是单价，不能偶联。将特异性不同的两个小分子抗体连接在一起可获得双特异性抗体。（,bispecific antibody,BsAb,），双价,ScFv,与抗原结合比单价敏感性高，亲和力大，结构和功能上都更接近亲本抗体。,BsAb,分子片段可从,Fab,、,Fv,或,ScFv,组建，可在体内或体外连接。,四、双特异性抗体,在小分子抗体的羧基端设计半胱氨酸残基，如带铰链区的,Fab,段或带半胱氨酸残基尾巴的,ScFv,，可在体外通过化学交联成为双价抗体分子，亮氨酸铰链也可用来构建，两个不同抗体连接成为功能抗体如抗体,CD3,和抗,IL-2R,的,Fab,在体外直接介导,T,细胞对表达,IL-2,的细胞有杀伤作用。,（一）双价抗体分子的构建,1.,体外构建,对小分子抗体基因的改造修饰，使细胞直接表达双抗体分子，比体外组建更有效，现有以下几种方法,:,2.,双抗体分子的细胞内组建,（,1,）设计促进双聚体形成的结构域，半胱氨酸是促进双聚体形成的结构域，使小分子抗体在大肠杆菌的分泌型表达过程中形成双体，亮氨酸拉链和甲基（,CH3,）亦有螺旋,转角,螺旋结构，使之成为双体。,（,2,）在基因构建上直接将两个抗体分子片段融合。,（,3,）双体分子 两个,ScFv,的,V,H,和,V,L,相互配对，可产生双价的双抗体分子。,能同时结合两种不同抗原，因而可介导标记物与靶抗原的结合，或某些高级分子定位于靶细胞。在临床上有以下应用：,（二）双特异性抗体的应用,1.,在免疫检测中的应用 一个臂结合靶抗原，另一个臂结合酶，不需用酶标记抗体，避免在标记过程中降低酶及抗体的活性。,2.,在肿瘤放射免疫显像中的应用 一个臂结合肿瘤细胞，另一个臂结合半抗原螯合剂，半抗原螯合剂能选择与放射性核素结合。放射免疫显像，清晰度和灵敏度高。,3.,双特异性抗体介导的药物杀伤效应 治疗肿瘤生物导弹如药物、毒素或核素。,4.,介导的细胞杀伤效应 一臂结合肿瘤抗原，一臂结合免疫活性细胞起介导作用并激活免疫细胞。,抗体库技术是指应用基因克隆技术将全套抗体重链及轻链可变区基因克隆出来，重组到质粒表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，最后筛选到特异的可变区基因，取决于两项技术的突破：一是,PCR,技术的发展，可用一组引物克隆出全套抗体的可变区基因，一是大肠杆菌表达分泌型抗体分子片段的成功。,五、抗体库技术及其应用,采用,RT-PCR,技术从淋巴细胞克隆出全套抗轻链基因和重链基因，将二者分别组建到表达载体中，得到轻链基因库和重链基因,Fd,段基因库，再通过,DNA,重组技术将轻链基因和,Fd,随重组于一个表达载体中，即形成组合抗体库。,（一）组合抗体库技术,1.,噬菌体显示 指将蛋白分子或肽段基因克隆到丝状噬菌体的基因组,DNA,中，使噬菌体表面表达该异源性分子，主要特点是在同一病毒颗粒内将特定分子的基因型和表型统一，在噬菌体表面表达特定蛋白，在该噬菌体核心,DNA,中含有该蛋白的基因。,（二）噬菌体抗体库技术,2.,噬菌体抗体 将抗体分子片段与噬菌体外壳蛋白融合，使之表达在噬菌体表面，形成噬菌体抗体，将全套抗体可变区基因，组装到表达载体，其抗体表达到噬菌体表面，得到噬菌体抗原。,在诊断、治疗中具重要意义，还有人源性抗体比鼠源性抗体的副作用低，很有发展前途。,1.,在抗感染中的作用 对细菌产生的毒素、病毒感染。,2.,在肿瘤治疗中的作用 一是抗体直接作用于肿瘤，一是抗体连接药物、毒素、酶及细胞因子等3,抗独特异抗体 抗原内影像来代替相应抗原，因为这种抗原量少或难于获得。,（三）抗体库的应用,小分子抗体都是单价，不能偶联。,其基本过程是将激活的T细胞与酶缺陷型T淋巴细胞瘤细胞融合，可表达特异性 TCR 或其他功能的杂交瘤T细胞，与 B 细胞相以，但细胞激活和阳性克隆筛选较为杂交，不稳定，简介主要步骤。,二、单克隆抗体的纯化,大多数抗原分子具有多个抗原决定簇（表位，epitope）。,其抗体部分与相应抗原特异性结合。,1.,653）、Sp2/0等。,介导的细胞杀伤效应 一臂结合肿瘤抗原，一臂结合免疫活性细胞起介导作用并激活免疫细胞。,另外还有其他杂交瘤技术，如人-人 B 淋巴细胞杂交瘤和鼠-人 B 淋巴细胞杂交瘤，人骨髓瘤细胞系体外建株比较困难，生长不稳定，有的分泌 IgE，有的分泌 Ig 的、链。,鼠单克隆抗体可变区基因克隆,一个抗原决定簇刺激一个B细胞克隆产生一种特异性抗体，一种抗原刺激机体产生多种抗体称为多克隆抗体（polyclonal antibody,PcAb）如免疫血清。,如将抗体的可变区基因与TCR的链和链恒定区融合，将融合基因导入T细胞，既表达特异性抗体，又表达TCR，该TCR不受MHC分子限制。,掌握杂交瘤技术的基本原理,第四章 单克隆抗体与基因,5）未融合的瘤细胞,一是糖和氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，进一步合成 DNA，叶酸是重要辅酶。,小分子抗体包括：抗原结合片段（fragment of antigen binding,Fab），可变区片段（fragment of variable region,Fv）,单链抗体（single chain Fv,ScFv），单区抗体。,Ag,Id,抗,-Id,抗原的内影象,THANK YOU,谢谢观看,