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无菌检查无菌检查 陈晨 2018.07.02 152一、无菌检查一、无菌检查环境保证培养基保证有效的方法SOP操作有效的结果无菌性检查灵敏度检查方法确认可靠的结论结果判断153二二、检测标准、检测标准v中华人民共和国药典2015版 四部 1101 无菌检查法vGB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物学试验方法vISO 11737-2 2009 医疗设备的灭菌微生物学方法 第二部分：灭菌过程中无菌测试的定义，验证及维护154三、检测环境三、检测环境2015版药典要求1101 无菌检查：无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求。9203 药品微生物实验室质量管理指导原则：无菌检査应在B级背景下的A 级单向流洁净区域或隔离系统中进行，单向流空气、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。GB/T 14233.2-2005：无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求。155四、菌种的选择四、菌种的选择菌株名称及编号菌种分类无菌检查适用性培养基查适用性金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003革兰氏阳性菌大肠埃希菌CMCC(B)44102革兰氏阴性菌、对抑菌性敏感铜绿假单胞菌CMCC(B)10104革兰氏阴性菌、对营养物质要求高生孢梭菌CMCC(B)64941厌氧菌枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501芽孢杆菌白色念珠菌CMCC(F)98001酵母菌黑曲霉CMCC(F)98003霉菌注：菌株传代次数不得超过5次。156五五、实验材料准备、实验材料准备v1、实验所需的培养基及稀所需的培养基及稀释液（液（2015版版药典）典）胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养流乙醇酸盐流体培养基用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌培养。胰酪大豆胨琼脂培养基用于细菌的计数沙氏葡萄糖琼脂培养基用于霉菌的计数157五、实验材料准备五、实验材料准备v2、培养基配制、培养基配制直接购买配制好的干粉培养基，按照培养基包装上的说明，取规定量的干粉培养基及纯化水进行配制，按121，15min进行灭菌，灭菌后冷却至室温备用。药典规定：配制好的培养基应保存在225，非密闭容器，一般三周以内使用。158五、实验材料准备五、实验材料准备v3、培养基适用性、培养基适用性检查无菌性无菌性检查排出培养基本身的排出培养基本身的污染，避染，避免无菌免无菌试验过程中由培养基引起的假阳性程中由培养基引起的假阳性灵敏度灵敏度检查确保培养基确保培养基营养性良好，养性良好，对微生物具有生微生物具有生长促促进作用，排出无菌作用，排出无菌试验过程程中由培养基引起的中由培养基引起的假阴性假阴性注：用于无菌检查的培养基必须经过培养基适用性检查。159五、实验材料准备五、实验材料准备v3、培养基适用性、培养基适用性检查培养基菌株数量菌量培养FTM(12ml)金葡2100cfu/ml30353天铜绿2生孢2阴性1/无菌性5/303514天TSB（9ml）枯草2100cfu/ml20255天白念2黑曲霉2阴性1/无菌性5/202514天1510五、实验材料准备五、实验材料准备v4、其他、其他实验材料材料带滤芯枪头量筒（100ml）剪刀、镊子无尘布以上物品可采样湿热灭菌121，30min。1511六、实验设备六、实验设备1、电子天平用于培养基干粉的称量2、压力蒸汽灭菌器用以培养基及实验物品的灭菌3、生化培养箱用于细菌的培养4、霉菌培养箱用于霉菌及酵母菌的培养5、生物安全柜用于实验环境的提供1512七、菌液的制备七、菌液的制备v菌株的准备：取1瓶复溶液和1瓶定量菌株，平衡至室温。在生物安全柜内，撕开菌株瓶的铝塑组合盖，在无菌操作下，取镊子过火焰灭菌后，待其冷却，用镊子打开菌株瓶的冻干塞，打开复溶液的螺旋盖并把菌株冻干粉倒入复溶液中，重新旋紧螺旋盖并漩涡震荡至少10秒确保菌株完全溶解，即得所需菌悬液（每0.1mL的菌悬液即含1099cfu）。1513八、验证方法八、验证方法v目的：确认无菌试验的产品是否具有抑菌性；如果有，如何去除，并被证实。v无菌检查方法有直接培养法和薄膜过滤法两种。v医疗器械最常使用的方法为直接培养法，薄膜过滤法适用于液体类产品或供试品已转化为供试液的产品，本公司的产品制备成供试液后仍有颗粒杂质无法过滤，故选用直接培养法。1514八、验证方法八、验证方法直接培养直接培养法法培养基菌株菌量供试品组别培养流乙醇酸盐流体培养基金葡100cfu/ml试验组3035不得超过5天金葡阳性对照组大肠试验组大肠阳性对照组生孢试验组生孢阳性对照组胰酪大豆胨液体培养基枯草试验组2025不得超过5天枯草阳性对照组白念试验组白念阳性对照组黑曲霉试验组黑曲霉阳性对照组1515八、验证方法八、验证方法薄膜过滤薄膜过滤法法供试品稀释、过滤菌株菌量培养基组别培养金葡最后一次冲洗液加菌100cfu/ml流乙醇酸盐流体培养基试验组3035不得超过5天金葡阳性对照组大肠试验组大肠阳性对照组生孢试验组生孢阳性对照组枯草胰酪大豆胨液体培养基试验组2025不得超过5天枯草阳性对照组白念试验组白念阳性对照组黑曲霉试验组黑曲霉阳性对照组1516八、八、验证验证方法方法结果判断结果判断v与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检査。v如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。1517九、产品有抑菌性的措施九、产品有抑菌性的措施v1、增加冲洗量v2、增加培养基的用量 v3、使用中和剂或灭菌剂v4、更换滤膜品种注：消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验日常无菌检查阳性对照菌的选择：无抑菌作用及抗革兰氏阳性菌为主的供试品，选择金黄色葡萄球菌为对照菌。1518十、日常无菌检查十、日常无菌检查无菌检查室供试品接入培养基FTM+供:2管TSB+供:1管阴性:各1管（FTM、TSB）准备间培养基、供试品、灭菌物品的准备阳性对照室取其中一管FTM+供，加入1100cfu金黄色葡萄球菌准备间FTM+阴:3035TSB+阴:2025培养14天阳:3035培养72小时以内结果判断阳性：生长良好阴性：无菌生长供：无菌生长1519 谢谢！