肿瘤转移专题知识讲座培训课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,肿瘤转移专题知识讲座,*,肿瘤转移专题知识讲座,第一部分,肿瘤的生长方式和生长速度,一、肿瘤的生长方式,2,肿瘤转移专题知识讲座,大多数良性肿瘤呈膨胀性生长。常有纤维性包膜，容易手术切除，切除后不复发。但血管瘤是一个例外，不呈膨胀性生长，而呈浸润性生长。,1.膨胀性生长,(,Expansive growth,),：,3,肿瘤转移专题知识讲座,恶性肿瘤常呈浸润性生长。肿瘤无包膜形成，境界不清。局部切除后，常有肿瘤残留，容易复发。,浸润是恶性肿瘤的标志之一。,2.浸润性生长,(,Infiltrative growth,),4,肿瘤转移专题知识讲座,良性肿瘤、恶性肿瘤都可以有这种生长方式。,良性肿瘤基底部无浸润，而恶性肿瘤则伴有基底浸润。,3.外生性生长,(,Exophytic growth,),：,5,肿瘤转移专题知识讲座,二、肿瘤的生长速度,肿瘤的生长速度主要取决于：,1、肿瘤的分化成熟程度,一般说,，,良性肿瘤分化好，生长缓慢,；,而恶性肿瘤分化差，生长较快。,6,肿瘤转移专题知识讲座,2、倍增时间：,即肿瘤细胞增加一倍所需要的时间,3、生长分数（增殖指数）：,即处于增殖状态（S、G2、M）的细胞比例,生长最旺盛的肿瘤增殖指数也仅有20%左右。,7,肿瘤转移专题知识讲座,4、肿瘤细胞的生成与丢失,增多=生成-丢失,丢失：凋亡、坏死,8,肿瘤转移专题知识讲座,5、血管生成（Angiogenesis),肿瘤生长的关键因素,血管形成的机制：,肿瘤细胞产生,血管生成因子,vascular endothelial growth factor(VEGF),basic fibroblast growth factor(bFGF),肿瘤/间质产生,血管生成抑制因子,血管生成 生成抑制,9,肿瘤转移专题知识讲座,恶性肿瘤由于生长快，但血管形成慢，造成供血不足,，,常易发生坏死,、,溃疡,、,出血等继发性改变,。,10,肿瘤转移专题知识讲座,11,肿瘤转移专题知识讲座,第二部分 肿瘤的扩散,良性肿瘤仅在原发部位生长扩大，而具有浸润性生长的恶性肿瘤，不仅可以在原发部位继续生长、蔓延(直接蔓延)，而且还可以通过各种途径扩散到身体其他部位(转移)。,12,肿瘤转移专题知识讲座,一、直接蔓延,肿瘤沿组织间隙、淋巴管、血管、神经束向邻近组织和器官侵袭蔓延。,13,肿瘤转移专题知识讲座,二、转移(,Metastasis,),肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，被带到其他部位继续生长，并形成与原发部位肿瘤组织学类型相同的肿瘤，这个过程叫,转移,。原发部位的肿瘤叫原发瘤，所形成的新肿瘤叫继发瘤或转移瘤。,14,肿瘤转移专题知识讲座,转移是恶性肿瘤最本质的表现,。,良性肿瘤不转移,，,只有恶性肿瘤才发生转移,。,恶性肿瘤中,，,只有少数肿瘤不发生或很少发生转移,，,如皮肤的基底细胞癌,、,脑的恶性胶质细胞瘤,。,应当指出,，,浸润是转移的基础,。,15,肿瘤转移专题知识讲座,1.淋巴道转移,：,淋巴道转移是癌转移的重要途径，少数肉瘤如滑膜肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤也可发生淋巴道转移。,淋巴道转移与淋巴引流的方向相同，但少数情况下也可发生跳跃转移或逆行转移,。,16,肿瘤转移专题知识讲座,瘤细胞侵入淋巴管，随淋巴液进入局部淋巴结，先聚集在边缘窦，逐渐累及破坏整个淋巴结，并可进一步转移到下一站引流淋巴结，最终经胸导管进入体循环。受累的淋巴结肿大、变硬、互相粘连成团，切面灰白而干,燥,。,17,肿瘤转移专题知识讲座,18,肿瘤转移专题知识讲座,19,肿瘤转移专题知识讲座,20,肿瘤转移专题知识讲座,2.血道转移,：,血道转移是肉瘤转移的重要途径，少数癌如肾细胞癌、肝细胞癌、肺癌以及其它癌的晚期也发生血道转移。,肝、肺是两个血道转移的靶器官。,21,肿瘤转移专题知识讲座,肿瘤侵入血管，随血流运行，到达远隔器官。肿瘤栓子进入门静脉引起肝转移；进入体静脉引起肺转移；进入肺静脉引起全身性转移；进入胸、腰、盆腔静脉，可通过吻合支，进入脊椎静脉丛引起脊椎、脑转移。,22,肿瘤转移专题知识讲座,23,肿瘤转移专题知识讲座,24,肿瘤转移专题知识讲座,25,肿瘤转移专题知识讲座,26,肿瘤转移专题知识讲座,3.种植性转移,：,体腔内器官的肿瘤累及到器官的表面时,，,瘤细胞可脱落并种植到体腔各器官的表面,，,形成种植性转移瘤,。,腹腔,、,胸腔最常受累,，,心包腔,、,蛛网膜下腔亦可受累,。,常在浆膜面形成多数转移结节,，,很少侵入器官的深层,，,并常伴血性积液,，,积液内可查到肿瘤细胞,。,27,肿瘤转移专题知识讲座,28,肿瘤转移专题知识讲座,4.接触转移,：,非常罕见。如下唇肿瘤转移到上唇的接触部位。,29,肿瘤转移专题知识讲座,（二）浸润转移的机制,30,肿瘤转移专题知识讲座,1、浸润的机制,1）肿瘤细胞,解离,(Detachment)：,细胞间连接分子 E-cadherin 表达下降,2）肿瘤细胞,附着,(Attachment)于基底膜:,细胞表面的,整合素,（Integrin)的量和分布改变:laminin 受体,fibronectin 受体,31,肿瘤转移专题知识讲座,3）消化基底膜和细胞外基质（Extracellular Matrix):,肿瘤/间质细胞分泌酶：IV型胶原酶（金属蛋白酶，Metalloproteinase MP）等,消化基底膜、间质的胶原、糖蛋白、蛋白多糖,4）肿瘤细胞,移动,（Migration):,阿米巴运动：自主、趋化,32,肿瘤转移专题知识讲座,2、转移的机制,浸润是转移的基础,转移过程：,1）穿过基底膜：细胞解离、消化、移动,2）穿过细胞外基质：消化、移动,3）穿过血管壁：消化、移动,33,肿瘤转移专题知识讲座,4）入血循环：,大部分被清除、血小板粘附、瘤栓,5）附着血管壁/栓塞,6）穿过血管壁：消化、移动,7）血管生成：转移瘤形成,34,肿瘤转移专题知识讲座,3、抑制,浸润,可抑制转移,增加E-cadherin 的表达,金属蛋白酶(MP)抑制因子：,Tissue Inhibitor of Metalloproteinase(TIMP),消化 抑制,35,肿瘤转移专题知识讲座,4、抑制,血管生成,也可以抑制转移,因为血管生成是,转移瘤形成和生长,的关键因素之一,36,肿瘤转移专题知识讲座,第三部分 肿瘤的分级与分期,37,肿瘤转移专题知识讲座,一、肿瘤的分级,恶性肿瘤的分级是根据其分化程度的高低来确定恶性程度的级别。,比较广泛使用的是三级分法，即将恶性肿瘤分为高分化、中分化、低分化三级。这种分级对于决定治疗方案和判定预后有一定意义。,38,肿瘤转移专题知识讲座,39,肿瘤转移专题知识讲座,40,肿瘤转移专题知识讲座,分化、异型性、间变、浸润/转移能力,分化异型性间变浸润/转移,良性肿瘤,高小无无,恶性肿瘤较差明显可有有,高：较小者 无较低,中：中等可有中等,低：大可有高,41,肿瘤转移专题知识讲座,二、肿瘤的分期,较为常用的是,TNM,分期。,T,：,Tumor,，表示肿瘤，根据一个特定肿瘤的体积，分为四级，分别用,T1、T2、T3、T4,表示，肿瘤越大，级别越高。,42,肿瘤转移专题知识讲座,N,：,Lymph Node,，表示淋巴结转移的情况。,M,：,Metastasis,，表示有无远隔转移。,M,o、,M,1、,M,2,N,o：没有淋巴结转移。,N,1：只有少数淋巴结转移。,N,2：很多淋巴结转移。,43,肿瘤转移专题知识讲座,第四部分 肿瘤的微转移,44,肿瘤转移专题知识讲座,一、前言,肿瘤治疗失败的主要原因,不能早期发现和控制,微转移,。,实体恶性肿瘤来说，血转移是最严重和最常见的。,外周血肿瘤微转移的检测对于肿瘤患者治疗方案的选择具有重要意义。,肿瘤细胞的富集,可大大提高,流式细胞术,、,RT-PCR,、,免疫组织化学,和,端粒酶活性分析,等的灵敏度和特异度。,45,肿瘤转移专题知识讲座,血液循环中肿瘤细胞的检测有2个问题需要解决：,寻找特异性高的肿瘤标志物；,建立灵敏度高的实验方法。,46,肿瘤转移专题知识讲座,2 肿瘤细胞血行转移的原理,47,肿瘤转移专题知识讲座,3 外周血中检测微量肿瘤细胞面临的难题,一是肿瘤特异性的生物标记,二是高灵敏度的实验方法,48,肿瘤转移专题知识讲座,4 免疫磁珠技术,免疫磁珠（Immunomagnetic beads,IMB）是包被有单克隆抗体的磁性微粒。,分离富集,骨髓细胞、血液细胞、肿瘤细胞,核酸,细菌,有2种形式：,1）阳性筛选：IMB与与被选物质结合,2）阴性筛选,49,肿瘤转移专题知识讲座,抗CD-45免疫磁珠阴性去除白细胞,Ber-EP4免疫磁珠阳性富集,上皮性,癌细胞,LS174T,50,肿瘤转移专题知识讲座,用,RT-PCR,技术检测肿瘤细胞,逆转录,-,聚合酶链反应（,RT-PCR,）,优点,：敏感性高、特异性强的,使检测外周血中的少量癌细胞成为可能。,理论依据：,血浆中含有大量的,RNA酶,，一旦血浆中出现RNA立即会被水解掉，血浆中就不可能有游离的mRNA，,通过RT-PCR检测到的mRNA必然是来自外周血中,完整,的循环细胞。,51,肿瘤转移专题知识讲座,单独使用RT-PCR检测外周血肿瘤细胞的方法具有一定的假阳性率。,如：以CK19基因作为上皮性肿瘤标志物的假阳性率高达50%。,免疫磁珠,RT-PCR,灵敏度,、特异度,解链温度测定,52,肿瘤转移专题知识讲座,二、,材料与方法,研究对象：胃癌41例，良性胃病10例，5例对照。,参照模型的建立：胃癌MGC-803细胞10倍稀释，加入至4 ml健康人血液中。,单核细胞的分离,实验方法分类,：,A方法,（对照）,：非免疫磁珠法。,B方法,：阴性免疫磁珠筛选法。CD45免疫磁珠（宁波新芝生物科技股份有限公司生产）,C方法,：阳性免疫磁珠筛选法。Ber-EP4免疫磁珠（挪威Dynal公司生产）,D方法,：联用阴性和阳性免疫磁珠筛选法。,53,肿瘤转移专题知识讲座,免疫磁珠富集后，癌细胞的检测方法,荧光定量RT-PCR检测以下2个基因的mRNA：,2微球蛋白（2 mircoglobulin,2M）,癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）,相对CEA mRNA值=Cp,(CEA),/Cp,(2M),Cp:Crossing point 扩增产物开始对数增加点,54,肿瘤转移专题知识讲座,三、结果,胃癌MGC-803细胞加入到健康人血中,HE,400,55,肿瘤转移专题知识讲座,CD45免疫磁珠与白细胞结合,400,56,肿瘤转移专题知识讲座,阳性免疫磁珠与癌细胞结合,HE,1000,57,肿瘤转移专题知识讲座,CEA mRNA的实时定量RT-PCR检测,58,肿瘤转移专题知识讲座,CEA mRNA RT-PCR扩增产物的其解曲线分析,59,肿瘤转移专题知识讲座,2M mRNA 的Cp值与细胞数的相关性,60,肿瘤转移专题知识讲座,正常人血中加入MGC-803胃癌细胞后,相对CEA mRNA的定量检测结果,61,肿瘤转移专题知识讲座,41例胃癌病例CEA mRNA的检测结果,*,62,肿瘤转移专题知识讲座,阳性病例与临床分期的关系,*,63,肿瘤转移专题知识讲座,实验结果免疫磁珠富集结肠癌细胞,Ber-Ep4免疫磁珠富集的LS174T细胞(HE400),Ficoll 分离的外周单核血细胞(HE400),CD45免疫磁珠阴性筛选的白细胞(HE200),64,肿瘤转移专题知识讲座,实验结果,实时定量RT-PCR检测特异性mRNA,Representative results of real-time RT-PCR for amplifying,2M mRNA.Three methods were used to sort cancer cells from the healthy blood spiked with colon cancer LS174T cells followed by quantitative RT-PCR.Their concentrations are 1000 cells/ml blood.,negative,immunobead,method;,positive,immunobead,method;,negative-and-positive,immunobead,method;,(control)no RNA,65,肿瘤转移专题知识讲座,Results of amplifying CK20 mRNA in recovery experiment.(A)Firstly,different concentrations of LS174T colon cancer cells were spiked into healthy blood.Then,negative and positive immunomagnetic beads were successively used to enrich cancer cells.Finally,the CK20 mRNA was detected by real-time quantitative RT-PCR.(a)10000/ml;(b)1000/ml;(c)100/ml;(d)10/ml;(e)1/ml;(control)unspiked blood.,(B)Standard curve plot of the log of LS174T cells,versus,the cycle number of crossing point.,66,肿瘤转移专题知识讲座,Representative results of amplifying CK20 mRNA in peripheral blood from patients with colorectal cancers.(a)positive control:1000/ml of LS174T colon cancer cells spiked into healthy blood;(b)and(c)colorectal cancer patients;(control)no RNA was added into the RT-PCR reaction solution.,67,肿瘤转移专题知识讲座,Dukes stage No.of patients No.of patients positive,for CK20 RT-PCR(%),A 2 0(0.0),B 9 3(33.3),C 1513(86.7)*,D 1413(92.9)*,values in parentheses are percentages.,*,P,0.05(,vs,A),Students,t,test,Table 1,The positive detection rates of CK20 mRNA in peripheral blood from patients with colorectal carcinoma,68,肿瘤转移专题知识讲座,Factors Patients(,n,)Positive detection(,n,)Percentage (%),Diameter,5 cm 24 23 95.8*,5 cm 16 6 37.5,Differentiation,High 14 10 71.4,Middle 15 11 73.3,Low 11 8 72.3,Lymphatic metastasis,Positive 2321 91.3*,Negative 17 8 47.1,Hepatic metastasis,Positive 1414 100.0*,Negative 2615 57.7,*,P,0.01(,vs,5 cm group);*,P,0.05(,vs,Negative group),2,analysis,Table 2,The relationship of positive CK20 mRNA detection in peripheral blood and clinicopathological factors in patients with colorectal carcinomas.,69,肿瘤转移专题知识讲座,HepG2三组预实验结果,70,肿瘤转移专题知识讲座,患者血样的收集,(2003.9-2004.12),71,肿瘤转移专题知识讲座,不同肝病患者和健康人外周血中AFP mRNA的扩增值,HCC 207 276,LC 30 34,hepatitis 13 18,normal 3 5,HCC,vs,LC:,P,=0.0137;HCC,vs.,Hepatitis:,P,=0.0027;,LC,vs,Hepatitis:,P,=0.0673;HCC,vs.,Normal:,P,=0.0028;LC,vs,Normal:,P,=0.0025;Hepatitis,vs,Normal,P,=0.0284,73,肿瘤转移专题知识讲座,肝病患者的不同疾病期相对应的AFP mRNA的阳性率,74,肿瘤转移专题知识讲座,肝病患者血清AFP值与AFP mRNA及阳性率的关系,75,肿瘤转移专题知识讲座,HCC患者中血清AFP与AFP mRNA 的关系,76,肿瘤转移专题知识讲座,外周血中AFP mRNA与几个反应肝功能的临床指标之间的联系,77,肿瘤转移专题知识讲座,四、讨论,RT-PCR方法是目前用于检测外周血肿瘤细胞的常用分子生物方法,当循环血中标志,mRNA,的拷贝数较少或者血液细胞有相应基因的低水平表达时，可出现假阳性或假阴性,CEA,也可低水平表达于血细胞和淋巴结。,以,CEA,mRNA,作为标志分子对外周血非造血系统肿瘤细胞进行检测时，有必要先,去除血细胞,。,78,肿瘤转移专题知识讲座,使用免疫磁珠筛选外周血存在的非造血系统恶性肿瘤细胞的策略有2种：,1 阴性筛选,2 阳性筛选,CD45抗原表达于除了红细胞和血小板及其前体细胞外的所有造血源细胞。,CD45免疫磁珠可去除CD45,细胞，用于富集外周血、骨髓和淋巴结中的非造血系统肿瘤细胞。,国外报道：用这种阴性筛选方法可使非造血系统肿瘤细胞浓缩9倍。,79,肿瘤转移专题知识讲座,免疫磁珠分选技术,80,肿瘤转移专题知识讲座,外周血白细胞也可能成为免疫磁珠筛选肿瘤细胞的可能污染源之一。,有报道指出，经免疫磁珠筛选后还有不超过100个外周血白细胞可保留在肿瘤细胞层中。,本实验结果也显示，先使用阴性免疫磁珠去除大量的白细胞后再使用阳性磁珠可大大减少血细胞的污染。,本实验方法对于胃癌的早期诊断和及时发现转移均有一定的临床意义。,81,肿瘤转移专题知识讲座,对于循环血癌细胞的检测方法必须具有：,（1）较高的灵敏度以检测极微量的癌细胞,（2）较高的特异性以排除血细胞的干扰,本研究的特点：,（1）先用免疫磁珠进行阴性筛选以去除绝大部分的白细胞,（2）然后用免疫磁珠进行阳性筛选富集外周血中的结肠癌细胞,（3）最后用特异性高的定量RT-PCR检测癌细胞,为早期发现转移、指导治疗和评价预后提供依据,82,肿瘤转移专题知识讲座,五、小结,阴性免疫磁珠可以消除外周血白细胞对肿瘤血道微转移检测的干扰,联用阴性免疫磁珠和RT-PCR对于外周血肿瘤细胞的检测与分析具有较大的推广价值,83,肿瘤转移专题知识讲座,第五部分 以微小RNA作为标志物检测外周血中的肿瘤细胞,微小RNA是长度为22个核苷酸左右的在翻译水平调控基因表达的非编码RNA，与肿瘤关系密切。,84,肿瘤转移专题知识讲座,正常人,SGC-7901胃癌细胞,正常人,+,SGC,胃癌病人,SGC-7901胃癌细胞,正常人,+,SGC,CK20,CK18,85,肿瘤转移专题知识讲座,Levels of miR-106a(a)and miR-17(b)in mononuclear cells from preoperative(,n,=41)patients with gastric cancer were higher than those from healthy volunteers(,n,=27).,Patients vs control,p,=0.006(a);,p,=0.001(b),86,肿瘤转移专题知识讲座,Receiver operation characteristics(ROC)curve of the miR-106a,miR-17 and combination in peripheral blood mononuclear cells.The AUC of miR-106a,miR-17 and combination are 0.684,0.068(,p,=0.0066),0.743,0.064(,p,=0.0001),and 0.741 0.064(,p,=0.0002),respectively.,87,肿瘤转移专题知识讲座,