免疫学诊断.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,*,分子诊断学,分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用,基因和蛋白质分析技术和方法,来研究人体内源性或外源性生物大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的监测、诊断、疗效判断和预后评估、个体化治疗等提供信息和决策依据的一门科学。,随着分子诊断技术的不断发展，分子诊断已从传统的,DNA,诊断概念发展到更全面的,核酸和蛋白质,诊断的新概念；分子诊断的内容也从早期的单一遗传性疾病的诊断发展成为覆盖临床医学、预防医学等众多领域的重要技术。,1,生化产品,30,免疫产品,25%,基因产品,5,8,血液分析产品,8,10,尿液分析产品,3,5%,微生物产品,2,3,诊断试剂仅占生物技术产业的25%,2005年国内临床诊断市场,2,免疫学检验项目分布情况,Infectious diseases,Tumor markers,Source:UBS Warburg LLC estimates,免疫学技术在临床诊断领域中的作用将越来越重要,3,(1)抗原抗体的性质,(2)温度,(3)酸碱度（PH）,(4)电解质（离子强度）,影响抗原抗体反应的因素,6,1、,天然抗原,2、重组抗原,3、合成肽,1、,多克隆抗体,2、单克隆抗体,3、基因工程抗体,抗原,抗体,抗原和抗体的类别,Georges J.F.Khler,Csar Milstein,1984 McAb,7,标记免疫学分析技术发展历程,免疫荧光分析(Coons,1941),放射免疫分析(Berson和Yalow,1960),酶联免疫吸附分析(Engvall,1971),金标免疫分析(Faulk和Taylor,1971),化学发光免疫分析(Arakawa，1977),时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979),电化学发光免疫分析(Leland,1990),8,免疫荧光,放射免疫,化学发光,电化学发光,时间分辨荧光,酶联免疫,标记免疫学分析技术发展历程,9,一、酶免疫分析技术,酶免疫技术,固相(ELISA),酶免疫组织化学,酶免疫测定,均相,异相,液相,10,酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA）基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，反应完成后加入酶反应底物，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。,(一)ELISA技术,11,来源方便，易于纯化；,比活性高，性质稳定；,与抗体或抗原交联后仍保持酶的活性；,待测物中不存在该酶及其底物、抑制剂和其它干扰因素；,酶活性和量能用简单、快速、敏感的方法测定。,标记用酶的要求,辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶,12,底物为邻苯二胺,(OPD),橙红色，检测波长,492nm,；,四甲基联苯胺,(TMB),，蓝绿色，检测波长,450nm,辣根过氧化物酶,13,碱性磷酸酶,底物为PNP（对硝基磷酸苯酯）,检测波长405nm。,14,固相的抗原或抗体,酶标记的抗原或抗体,酶作用的底物,ELISA的必要试剂,根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。,15,双抗体夹心法测抗原,双抗原夹心法测抗体,间接法测抗体,竞争法测抗体,竞争法测抗原,捕获包被法测抗体,BAS-ELISA,法,技术类型,16,(1)双抗体夹心法测抗原,此法适用于检验各种大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。,酶标抗体,样品,底物,酶标仪测定OD值,终止液,17,在一步法测定中，如标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成,“,夹心复合物,”,。所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应,(hookeffect),。,类风湿因子（,RF,）的干扰。,RF,是一种自身抗体，多为,IgM,型，能和多种动物,IgG,的,Fc,段结合。表现出假阳性反应。,(1)双抗体夹心法测抗原,18,反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。抗-HBs、抗-HCV、抗-HIV的检测常采用本法。,(2)双抗原夹心法测抗体,19,(3),间接法测抗体,一些传染病的诊断(Torch)。包被抗原利用,酶标二抗,建立检测相应抗体的方法。,酶标抗体,样品,样品稀释液,终止液,底物,20,21,(4),竞争法测抗体,当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。如抗-HBc等常用该方法。,酶标抗体,样品,底物,终止液,22,(5),竞争法测抗原,其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素(T3、T4)、药物等ELISA测定多用此法。,23,(6),捕获包被法测抗体,IgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。,此法常用于病毒性感染的早期诊断。,酶标抗体,特异性抗原,样品,终止液,底物,24,(7),BAS-ELISA法,：固相支持物；,：样品；,：特异性IgG；,：生物素化抗小鼠IgG（Biotin）；,：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）；,：DAB显色液；,：显色；,25,酶标记抗原或抗体的方法,1.戊二醛法,一步法：将HRP和抗体与戊二醛同时反应连接而成。,一步法操作简单，但所得产物质量不均一，抗体活性损失大，结合物的产率低。,二步法：将HRP按一定比例与戊二醛反应，形成HRP-戊二醛结合物，透析除去未结合的戊二醛后，再加入抗体。,二步法制备的结合物产量虽无提高，但质量均一，活性高。,26,酶标记抗原或抗体的方法,2.过碘酸钠法,过碘酸钠将酶分子上的糖羟基氧化成醛基，醛基与抗体（或抗原）中的游离氨基结合形成Schiffs碱，经NaBH还原生成稳定的酶结合物。,该法快速简便、安全，酶结合物的产率高、活性好，已成为目前最常用的酶标记方法。,27,酶标记物的纯化,硫酸铵盐析法,Sephadex,G-200,凝胶过滤,SPA,亲和层析,28,最适工作浓度的选择（间接法）,酶标抗体工作浓度,100ng/ml人 IgG,系列稀释酶标抗体,OD值约为1.0时的稀释度,包被抗原工作浓度,系列抗原稀释度包被,加入1:100稀释强阳性、,弱阳性、阴性对照,加酶标抗人IgG抗体,强阳性OD值约为0.8，,阴性OD值小于0.1,29,间接ELISA法包被抗原工作浓度的选择,参考血清,各抗原稀释度的吸光度值,1:50,1:100,1:200,1:400,1:800,强阳性,1.26,1.08,0.86,0.68,0.42,弱阳性,0.68,0.41,0.30,0.22,0.18,阴性,0.25,0.13,0.05,0.04,0.03,稀释液,0.09,0.02,0.02,0.02,0.04,30,双抗体夹心法工作浓度的选择(棋盘法),包被抗体浓度,酶标抗体稀释度,各抗原浓度的吸光度值,25ng/ml,1.5ng/ml,阴性,5,g/ml,1:2000,1:4000,1:8000,3,g/ml,1:2000,1:4000,1:8000,1,g/ml,1:2000,1:4000,1:8000,25ng/ml的抗原OD值约为0.8，阴性OD值小于0.1,31,固相载体的选择,包被,封闭,加样,保温,洗涤,显色,ELISA技术操作要点,32,不同批号的试剂盒不要混用。,整个实验过程应尽量建立在干净无尘的环境下进行。,试剂盒与待检样本使用前必须平衡至室温。,试剂盒试剂操作前的注意事项,33,酶标板最常用的材料是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。,酶标板,良好的酶标板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。,34,以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于10%。,酶标板的检定,35,包被液：碳酸盐缓冲溶液,(pH=9.6),PBS(pH=7.4),Tris-HCl,(pH=7.8),包被浓度：,100ng/ml-20ug/ml,温度和时间：在,4-8,过夜或,37 2,小时,包 被,36,封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。,0.05%-0.5%,的牛血清白蛋白,10%,的小牛血清,1%,明胶,5%,脱脂奶粉,封 闭,37,在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。,吸头应悬空，避免因吸头碰到小孔边缘或其中试剂而造成污染,每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染；,酶结合物工作液和底物可用多道加液器，使加液过程迅速完成。,加 样,38,37,是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度；,室温较,37,可避免蒸发，为加速反应，可辅以摇床振荡；,抗原抗体反应在,4,过夜反应更为彻底。,孵 育,39,决定着实验的成败,ELSIA靠洗涤来分离游离的和结合的酶标记物。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。常用洗涤液为pH7.4 PBS-Tween-20。,手工洗板时要注意防止气泡产生。,洗板机在使用前应进行校正注液量和残留量，注意管道是否通畅。洗涤时，确认每孔中的洗涤液都注满微孔，洗涤后，每个孔必须是干的，如果仍有水可倒扣在无尘吸水纸上拍干。,洗 涤,40,HRP-TMB显色系统受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。各类酸性终止液(2mol/LH,2,SO,4),则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。,显 色,41,ELISA试剂盒,（1）已包被抗原或抗体的固相载体；（2）酶标记的抗原或抗体(结合物)；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品(定性测定中)，参考标准品(定量测定中)；（5）标本稀释液；（6）洗涤液；（7）终止液。,42,实验仪器：,ELISA操作的标准化,变频振荡器,全自动酶联免疫分析仪,BIORAD550 酶标仪,BIORAD1575洗板仪,43,(1)在医学检测中的应用,病原体及其抗体的检测,蛋白质的检测,非肽类激素的检测,药物的检测,毒品检测,ELISA技术的应用,44,(2)在食品检测中的应用,食品微生物的检测,食品毒素的检测,食品中残留农药的检测,食品中残留抗生素的检测,转基因食品的检测,ELISA技术的应用,45,与放射免疫测定相比，标记物比较稳定，无放射性的危害。,与免疫荧光技术相比，结果判定更加客观。,操作简单，易自动化。,酶标仪普及、价格低廉。,ELISA技术的优点,46,O.D,值仅在低浓度范围与酶活性呈线性关系，,Hook,效应严重。,酶的活性容易失活，使,ELISA,的灵敏度不高。,ELISA,的大分子标记容易影响被标记物的空间结构，使得,ELISA,的灵敏度进一步提高受到限制。,ELISA技术的缺点,47,免疫组化技术又称免疫细胞化学，以酶标记抗体（或抗原）用于免疫学检测，通过相应底物被酶解后的显色反应，对细胞和组织标本中的抗原抗体复合物进行定位、定性分析和鉴定。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原。,(二)酶免疫组织化学技术,48,直接法,间接法,酶桥法,PAP,法,APAAP,法,亲和素生物素方法,主要类型,49,主要类型,直接法间接法 酶桥法PAP法,50,80%,甲醇,+0.3%H2O2,处理切片,15,30min,，封闭内源性过氧化酶的活性；,0.05%Tween-20/PBS,洗涤；,0.1,1%BSA,湿盒内孵育,15,25min,；,加第一抗体（,50,80l,），湿盒内孵育,1,2h,；,0.05%Tween-20/PBS,洗涤；,加,HRP,酶标记二抗,湿盒内孵育,45,60min,；,PBS,漂洗,3,次；,0.01,0.05%DAB,显色,10,15min,（暗处）。,实验步骤,51,52,放射免疫分析,(Radioimmunoassay,，,RIA)1959年由Berson和Yalow,创建，是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法，,RIA,将放射性核素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，,用于测定标本中抗原,或抗体的量。,二、放射免疫分析,Rosalyn Yalow,1977,53,放射免疫分析(RIA),+,Prior to Test,Labeled,Ag,+,Test,+,Patients,sample,Labeled,Ag,+,54,1968年Miles和Hales应用放射性核素标记的抗胰岛素抗体检测牛血清中胰岛素获得成功。为了区别于经典的放射免疫测定(RIA)，他们将其命名为免疫放射分析(immunoradiometric assay，IRMA)。,免疫放射分析,55,Solid,Phase,Ag,Immobilized,Ag in,Patients,sample,Labeled,Ab,免疫,放射,分析(IRMA),56,高比活度,适宜的半衰期,对抗原和抗体损害小,容易标记,放射性核素的选择原则,57,放射性核素,14,C,和,3,H,：半衰期长,(5730,年和,12.26,年,),，需在真空条件下标记，,射线测定需要液体闪烁技术，一般实验室不易开展，放射性废物处理困难，应用受限制。,131,I,和,125,I,：,125,I,化学性质活泼，易标记，含有酪氨酸的蛋白质和多肽均可标记；衰变过程不产生射线，可以晶体闪烁计数仪直接测量射线；,125,I,半衰期长,(60,天,),、比活度高,(95%),较,131,I(,半衰期,8,天，比活度仅,20%),更为适用。,58,125,I标记方法分类,直接标记法：标记含酪氨酸的化合物，可将,125,I,直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上，此,法操作简便，反应时间短，标记物的,比活度,高。,间接标记法：常用环核苷酸、前列腺素等小分子化合物的标记。先将,125,I,标记在载体上，再与蛋白质结合。,此法操作较复杂，标记蛋白质的比活度也低于直接法。但标记反应较为温和，可以避免因蛋白质直接加入,125,I,引起的生物活性的丧失。,59,125,I标记物的纯化,葡聚糖凝胶：Sephadex,分子量,700,1 500,5 000,1500,20000,型号,G10,G15,G25,G50,分子量,300070000,4000150000,5000800000,5000300000,型号,G75,G100,G150,G200,60,125,I标记物的鉴定,1.放射性化学纯度,是指结合于抗原上的放射性强度占总放射性总强度的百分率。一般要求游离碘含量占总放射性碘的5%以下。标记抗原在贮存过久后会出现标记物的脱碘，如游离碘超过5则应重新纯化去除这部分游离碘。,61,125,I标记物的鉴定,2.免疫活性,指标记抗原结合于抗体的放射性占总放射性的百分率。方法是用小量的标记抗原加过量的抗体(10倍量)，反应后分离结合部分(B)和游离部分(F)，分别测定放射性，算出B/T。此值应在80以上，该值越大，表示抗原损伤越少。,62,3.比度：,指单位化学量标记物中所含的放射性强度，即每分子被标记物平均所标记放射性原子数目，Ci/g、,Ci/,g等单位。,125,I标记物的鉴定,63,抗原抗体反应类型,1.平衡饱和法,指抗原和抗体反应达到再不结合、也不解离的平衡状态，称为饱和状态。操作时在反应管内同时加入标准品(或样品)、标记抗原和特异性抗体，混匀后在一定温度下孵育一定时间，使三种成分的反应几率相同。一般来说，平衡法的反应时间需较长，低温（4）或室温为1天，但操作方便，精密度较好。,64,抗原抗体反应类型,2.顺序加样法,将标准品(或样品)先与抗体一同温育反应一定时间，使抗原与抗体充分结合，甚至达到平衡，然后加入标记抗原再短时温育，与剩余的抗体结合，最后分离B与F。此法使非标记抗原与抗体结合形成复合物的几率大于标记抗原，相当于使非标记抗原具有较高的竞争能力，结果使剂量反应曲线的斜率增加，有利于提高分析的灵敏度。,65,RIA B、F分离方法,1.第二抗体沉淀法,在抗原与抗体反应后加入第二抗体，形成双抗体复合物。但因第一抗体浓度甚低，其复合物亦极少，无法进行离心分离，为此在分离时加入一定量的与一抗同种动物的血清或IgG，使之与第二抗体形成可见的沉淀物，与上述抗原的双抗体复合物形成共沉淀。经离心即可使含有结合态抗原（B）的沉淀物沉淀，与上清液中的游离标记抗原（F）分离。该血清或IgG通常称为分析试剂。,66,RIA B、F分离方法,2.聚乙二醇（PEG）沉淀法,是以PEG溶液代替第二抗体作沉淀剂。在测定不含有血浆蛋白的样品时，用PEG沉淀剂分离B、F，必须加适量蛋白或正常人混合血清，以增加蛋白的含量，便于沉淀。PEG沉淀剂的主要优点是制备方便、沉淀完全。缺点是非常特异性结合率比用第二抗体为高，且温度高于30时沉淀物容易复溶。,67,RIA B、F分离方法,3.PR试剂法,是一种将双抗体与PEG二法相结合的方法。此法保持了两者的优点，节省了两者的用量，而且分离快速、简便。,68,RIA B、F分离方法,4.活性炭吸附法,小分子游离抗原或半抗原被活性炭吸附，大分子复合物留在溶液中。在抗原与特异性抗体反应后，加入葡聚糖活性炭。放置510min，使游离抗原吸附在活性炭颗粒上，离心使颗粒沉淀，上清液中含有结合的标记抗原。此法适用于测定类固醇激素、强心糖苷和各种药物，因为它们是相对非极性的，又比抗原抗体复合物小，易被活性炭吸附。,69,IRMA B、F分离方法,固相分离法,利用聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯塑料试管（小珠）作为固相载体，将特异性抗体或抗原直接吸附于管壁（小珠），利用固相抗体或抗原分离B和F。,70,RIA与IRMA的比较,免疫放射分析,放射免疫分析,标记物,抗体,抗原,标记物用量,过量,限量,反应方式,直接结合，反应参数与待测抗原量成正比,竞争性结合，反应参数与待测抗原量成反比,反应速率,较快,较慢,B、F分离方法,固相抗体等,第二抗体等,特异性,高,较高,灵敏度,高,较高,71,所有试剂最好平衡到室温后加样。由于血清标准或样品长时间保存后会出现上稀下浓现象，分离剂更是如此，所以试剂包括样品在内加样前应摇匀。,不同批号的试剂最好不要混合使用。加样或溶解时，注意各试剂之间不要相互污染。,放射免疫分析实验注意事项,72,同次实验要保证所有管中加入的标记物、抗体完全一致。当一次检测大量样品时将两瓶或两瓶以上的标记物混合在一起后加样，以保证实验的一致性。,抽吸上清液时，应特别注意不要将沉淀抽走，否则将严重影响测定结果的准确性。,对于药盒,(100,管,),中提供,2,瓶标记物的多肽类产品，一般标记物、标准品稳定性欠佳，要求现用现溶，复溶后低温冰冻保存，应尽量减少液体状态放置的时间。,放射免疫分析实验注意事项,73,1、放射性（,125,I），对环境的污染及对身体的危害，该方法已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室）,2、,125,I 的半衰期短而导致其试剂有效期短。,3、标记物,125,I 的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。,4、操作繁琐，出报告时间长。,5、无法保存备用。,放,免技术的缺点,74,以荧光物质标记抗体进行抗原定位称为荧光抗体法；,用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称为荧光抗原法。,用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。,三、免疫荧光技术（FIA）,75,能与蛋白质分子形成共价键，结合后不易解离，未结合及其降解产物易清除；,荧光效率高，与蛋白质结合仍保持较高的效率；,荧光的颜色与背景组织的颜色对比鲜明,结合蛋白质后，不影响其活性,标记方法简单、结合物稳定，易于保存；,安全无毒，不具有附加的抗原性。,荧光色素应具备的条件,76,异硫氰酸荧光素（黄），,FITC,，,应用最广泛,呈黄绿色荧光，分子量为,389.4,。,四乙基罗丹明，,RB200,，,荧光效率低，多用于,FITC,的衬比染色或双标记，橙色荧光,四甲基异硫氰酸罗丹明，,TRITC,，发橙红色荧光。,藻红蛋白，,PE,，发橙色荧光，荧光强度比,FITC,强,19,倍。,常用荧光色素,77,荧光的标记,1.Marsshall方法,依据欲标记的蛋白总量,(,溶于生理盐水或碳酸盐缓冲液,),，按每毫克蛋白加,0.01mgFITC,。,边搅拌边将称取的,FITC,粉末逐渐加入球蛋白溶液中（,510min,内加完），加完后,4,持续搅拌,1218h,。,结合完毕后，将球蛋白溶液,2500r/min,离心,20min,，取上清装入透析袋中，用,pH8.0,缓冲盐水透析（,04,）过夜。,取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶,G-25,或,G-50,柱，分离游离,FITC,，。,78,荧光的标记,2.Chadwick方法,用,04 pH8.0 PBS,溶液将球蛋白溶液稀释至浓度为,3040mg/ml,，后冰浴。,按每毫克蛋白加入,FITC 0.01mg,，用,3%,重碳酸钠水溶液溶解。,将准备的抗体与,FITC,等量混合，充分搅匀后，在,04,冰浴结合,1824h,。,透析和层析同,Marshall,方法。,79,免疫荧光技术反应类型,80,直接法,滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，保温,30min,。,取出玻片，先用,PBS,冲洗后，再按顺序过,PBS,溶液三缸浸泡，每缸,3-5 min,，不时振荡。,取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，缓冲甘油封固，荧光显微镜观察。,Ag,Fluorochrome,Labeled Ab,Tissue Section,81,直接法需设置的对照,标本自发荧光对照：标本加12滴0.01mol/L pH7.4的PBS。,特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。,阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。,82,间接法,滴加适当稀释的抗体，,37,保温,30min,。,取出玻片，先用,PBS,冲洗,1,2,次，然后按顺序过,PBS,三缸浸泡，每缸,5min,，不时振荡。,取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴一定稀释度荧光标记的抗人球蛋白抗体。,37,保温,30min,。,重复操作,2,。,取出玻片，用滤纸吸去多余水分，缓冲甘油封固，荧光显微镜观察。,Ag,Fluorochrome,Labeled Anti-Ig,Tissue Section,83,间接法需设置的对照,阳性对照：阳性血清+荧光标记物。,阴性对照：阴性血清+荧光标记物。,荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。,阳性,对照,阴性,对照,84,补体法,吸取经适当稀释的免疫血清及补体等量混合液滴于切片上，,37,作用,30min,。,用缓冲盐水洗,2,次，每次,5min,，吸干标本周围水液。,滴加经过适当稀释的抗补体荧光抗体，,37,作用,30min,，水洗同上。,蒸馏水洗,1min,，缓冲甘油封固，荧光显微镜视野下观察。,85,补体法需设置的对照,阳性血清对照,正常阴性血清对照,灭活补体对照：将补体经,56,处理,30min,后，进行补体法染色。,86,双重染色法,一步法双染色,先将两种标记抗体按适当比例混合（,A+B,），按直接法进行染色。,二步法双染色,先用,RB200,标记的,B,抗体染色，不必洗去，再用,FITC,标记的,A,抗体染色，按间接法进行。,87,“一”：无或可见微弱荧光；,“,+”,：仅能见明确可见的荧光；,“,+”,：可见有明亮的荧光；,“,+”,：可见耀眼的荧光。,结果判定,88,89,应在暗室中进行检查。进入暗室后，点燃超高压汞灯,5,15min,，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。,防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。,检查时间每次以,1,2h,为宜，超过,90min,超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱。,免疫荧光技术实验注意事项,90,荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源，避免数次点燃光源。,标本染色后应立即观察，标本受紫外线照射,3,5min,后，荧光也明显减弱，若将标本放在聚乙烯塑料袋中,4,保存，可延缓荧光减弱时间。,免疫荧光技术实验注意事项,91,细菌学检验方面,病毒学检验方面,寄生虫学检验方面,自身抗体的检测,细胞免疫学方面,免疫荧光技术应用,92,标本不能永久保存，荧光有自然消退现象，需及时观察及照相；,有非特异性荧光的干扰；,对组织细胞进行微细结构的观察做不到；,用荧光显微镜观察；,需用经验丰富的技术人员。,免疫荧光技术的缺点,93,流式细胞术(flow cytometry,FCM),流式细胞术是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并可将不同类型的细胞分选收集。,Green Fluorescence Intensity,Number of Cells,Unstained cells,FITC-labeled cells,One Parameter Histogram,94,TRFIA是用,镧系稀土元素螯合物,标记抗体或抗原，检测标本中相应的抗原或抗体，用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。,四、时间分辨荧光免疫分析,（time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA）,95,TRFIA,中使用的镧系元素包括：铕,(,Eu,),、,钐（,Sm,),、,锝,(Tb),、镝,(,Dy,),等。,铕,(,Eu,),最为常用。,：标记物为稀土金属-镧系元素,96,镧系元素荧光特点：,荧光寿命极长,镧系元素螯合物（,600-900 us),铕：,714us,普通荧光免疫中荧光团：,1-100us,样本中蛋白质荧光：,1-10us,，,易猝灭。,Stokes,位移大（大约,290,nm,）,铕：发射光,613,nm,、,激发光,340,nm,，,荧光,素的,Stokes,位移,为,28,nm,。,荧光特异性强。,（发射光谱带很窄：,613 5nm,）,解离,-,增强技术可使其荧光性提高,100,万倍。,97,的技术特点（一）：,时间分辨,时间分辨：,利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光，而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0。,98,的技术特点（二）：,波长分辨,波长分辨：,发射光谱与激发光谱间存在的巨大Stokes位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离。,99,的技术特点（三）：,多标记,100,的技术特点（四）：,解离增强技术,增强液作用机理：,加入增强液后，可以使Eu3+从反应复合物中解离下来，游离的Eu3+同增强液中的另一种螯合剂形成一种胶态分子团，这种分子团在激发光的激发下能够发出强烈荧光，信号可以增强100万倍。,增强液是提高检测灵敏度的一个关键因素。,101,Wallac AutoDELFIA 1235,DR-M6601,102,五、化学发光免疫技术,化学发光酶免疫分析（,CLEIA,）,化学发光标记免疫分析,(CLIA),电化学发光免疫分析,(ECLIA),103,步骤与酶免疫测定相同，仅最后一步酶反应所用底物为发光剂，通过化学反应所发出的光在特定的仪器上进 行测定。,标记酶：,HRP,、,AP,发光剂：鲁米诺及衍生物、螺旋金刚烷环氧化物苯磷酸酯等,化学发光酶免疫分析,（chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA）,104,Ab,Ag,E,H,2,O,2,H,2,O,2,光信号检测器,鲁米诺,CLEIA原理,105,AXSYM,系统：美国雅培公司,ACS,系统：德国拜耳公司,LIAISON,系统：德国,Byk-Sangtec,公司,化学发光酶免疫分析,106,用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定。,发光剂：三价铁鲁米诺、吖啶酯,吖啶酯,/H,2,O,2,系统：即用吖啶酯标记抗体或抗原，用,H,2,O,2,和,NaOH,作发光启动试剂，固相载体为极细小的磁性颗粒。,化学发光标记免疫分析,（chemiluminescence immunoassay,CLIA）,107,+,发光物标记Ag,固相抗体,+,Ag,CLIA原理,108,Vitos,ECI,系统：美国强生公司,Access,系统：美国贝克曼公司,Immulite,系统：美国,DPC,公司,化学发光标记免疫分析,109,Ru(bpy),3,2+,为标记物,：,三,联吡啶钌为水溶性，高稳定性的小分子，可以确保电化学发光的高效性,及,稳定性，并且无噪音干扰。,TPA,：,类似,EIA,中底物，是,ECL,中的电子供体，氧化后生成的中间产物是形成激发态,Ru(bpy),3,2+,的化学能来源,电化学发光免疫分析,（electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA）,110,反应在阳电极表面进行,三联吡啶钌和TPA可同时失去电子发生氧化反应。二价的Ru(bpy),3,2+,被氧化成Ru(bpy),3,3+,，TPA被氧化成阳离子自由基TPA,+.,，后者失去一个质子，成为自由基TPA,.,，这是一个强还原剂，可将一个电子递给Ru(bpy),3,3+,，使其成为激发态的Ru(bpy),3,2+*,，而TPA自身被氧化成TPA氧化产物，激发态的Ru(bpy),3,2+*,在衰减时发射一个波长为620nm的光子，重新生成基态的Ru(bpy),3,2+,。这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号得以增强。,电化学发光免疫测定原理,111,Ru,2+,alkaline state,Ru,3+,TPA,TPA,l,TPA,+,l,H,+,e,-,Platinum electrode,Magnet,-,+,Ru,2+,acid state,Capturing of microbeadson electrode surface,电化学发光的发光及检测系统,微珠以及表面的凸凹使包被面积极联式放大。,载体悬浮于反应体系中，使异相反应成类似均相反应，大大加快反应速度。,磁性微珠方便吸引分离。,独特的磁性微粒子,113,Elecsys1010,Elecsys2010,E170,电化学发光全自动免疫分析系统,Elecsys2010,114,原理：以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细管作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金或,超顺磁性纳米微粒,结合物达到检测目的。,斑点金免疫渗滤技术（,DIGFA,或,GIFA,）,金标免疫层析技术（,GICA,）,磁性免疫层析技术（MICT）,六、金标和磁珠,免疫层析技术,115,斑点金免疫渗滤,(Dot immunogold filtration,DIGFA),盖,微孔膜,吸水垫料,底,116,金标免疫层析法,(Gold Immunochromatography Aassay,GICA),117,吸水纸,质控线,检测线,标记单抗及样品流动方向,吸水纸,吸水纸,吸水纸,阳性,阴性,失效,胶体金,免疫,层析试纸条的检测原理及结果判定,118,119,磁性免疫层析技术（Magnetic Immune Chromatographic Test，MICT）,MAR Magnetic,Immunoassay,Superparamagnetic,Particles 60-380nm,Oscillating Magnetic Field,Measures,Magnetization of,Magnetic particles,Enzyme substrate,Laser or visible light,Excitation,Visual,Absorption,Transmission,Reflection,Detection,Gold Colloid,Enzyme,Fluorophores,Luminescent,Molecules,Conventional,Immunoassay,=,Antibody,conjugate,120,试剂稳定,信号稳定,被测定物资磁性本底极低,克服视觉障碍,标准偶联技术,磁颗粒报告信号的优点,121,MICT的优点,光学检测,检测膜条检测带表面光学信号,磁信号检测,MICT 可检测膜条检测带上的磁信号,vs.,122,123,七、,免疫印迹(Western blotting),124,125,八、AlphaScreen分析技术,在均相条件下，将带有感光材料的感光微球,(纳米级)以及带有发光化合物的发光微球(纳米级)作为试剂和检测样品混合。由于在感光微球与发光微球表面带有生物活性分子(抗体或抗原)并能迅速捕捉被检测样品中的靶分子。感光微球、靶分子和发光微球三者共同形成免疫夹心复合物。激发光照射后，感光微球被诱导激活，并释放高能态的活性氧离子。该高能态的活性氧离子在近距离被发光微球俘获，从而传递能量以激活发光微球中的发光化合物并最终激发三价铕原子发出时间分辨荧光。而当样本不含靶分子时，无法形成免疫夹心复合物，虽然在光激下活性氧离子从感光微球中释放,无法到达发光微球,即在液相中迅速淬灭从而无时间分辨荧光产生。,126,Emission,610 nm,发光珠,1,O,2,A,B,Excitation,680 nm,感光珠,200nm,Excitation,680 nm,感光珠,1,O,2,A,发光珠,C,AlphaScreen分析技术,127,操作流程,1.20l发光微珠,2.20l,标准或样品,3.20l,生物素化抗体,4.175l,感光微粒,37,孵育,30,分钟直接检测,发射光,610 nm,发光珠,1,O,2,A,B,激发光,680 nm,感光珠,200nm,128,AlphaScreen分析技术-突出优点,时间分辨,低本底、灵敏度高、特异性强。,均相反应,反应时间短，线性范围宽。,不需洗涤,操作简便，易自动化，适合高通量检测。,129,免疫学检验技术发展趋势,快速简便,精确灵敏,集成高通量,金标免疫层析检测,磁珠免疫层析检测,化学发光,时间分辨荧光,AlphaScreen,阵列芯片,液相悬浮芯片,130,免疫学检测方法的评估,敏感性,=,真阳性,/(,真阳性+假阴性),100%,特异性,=,真阴性,/(,假阳性+真阴性),100%,131,免疫学检测试剂分析性能评估,灵敏度,线性范围,准确度,特异性,精密度,干扰试验,比对试验,132,ELISA,技术的主要类型及主要操作步骤。,ELISA,技术的应用。,免疫荧光技术实验注意事项。,RIA,技术,B,、,F,分离方法。,时间分辨荧光免疫分析技术特点。,标记免疫分析技术的种类及常见示踪物。,思考题,133,