上海交通大学微生物实验实验八质粒提取.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验八,质粒提取、病毒培养,实验目的,理解碱裂解法制备质粒,DNA,的原理,掌握提取质粒,DNA,的方法,掌握,DNA,琼脂糖凝胶电泳的原理,掌握,DNA,电泳操作及,DNA,分子量大小的测定,一、质粒的一般生物学特性,质粒,(plasmid),是独立于细菌染色体以外的能自我复制的环状闭合的双股,DNA,，质粒,DNA,一般为细菌染色体的,3%,左右,作为基因克隆质粒载体的所有质粒,DNA,分子都必定包括如下三个共同的组成部分,:,复制基因、选择标志基因和克隆位点。,质粒广泛存在于细菌细胞中,此外在霉菌、蓝藻、酵母和某些动植物细胞中也发现有质粒存在。,大肠杆菌乳糖操纵子简介：,I:,调节基因,P:,启动子,O:,操纵基因,Z,、,Y,、,A:,结构基因,其中,Z,编码,-,半乳糖甘酶,(-galactosidase),Y,编码透性酶,(permease),A,编码乙酰基转移酶,(acetylase).,I,P,O,Z,Y,A,Ori:,复制子,：,multiple cloning sites,多克隆位点,溶液,I,，,50 mM,葡萄糖,/25 mM Tris-Cl/10 mM EDTA,，,pH 8.0,溶液,II,，,0.2 N NaOH/1%SDS,；,溶液,III,，,3 M,醋酸钾,/2 M,醋酸；,溶液,：酚：氯仿：异丙醇,25,：,24,：,1,所用溶液,质粒的提取,p143,（,1,）新鲜培养含有质粒的细菌,（,2,）取,1ml,培养物加入,1.5ml,离心管中，,10000rpm,离心,2 min,。,（,3,）倒掉上清，尽可能倒干净。,（,4,）细菌沉淀重悬于,100ul,的溶液,中，用 移液枪吹打至均匀。须确使细菌沉淀在溶液中完全分散,(,三种成分各发挥什么作用？）,。,操作程序,（,5,）加,200l,新配制的溶液,（问什么现配现用？怎样发挥作用的？严格控制时间，为什么？）,盖紧管口，颠倒离心管几次（不要振荡），以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液,接触。于室温放置,-3,分钟至液体清亮。,（,6,）,加,150l,的溶液,(2,种成分发挥怎样的作用？仔细观察，发生了什么现象？）,盖紧管口，颠倒离心管几次（不要振荡），以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液,接触。,（,7,）,410000rpm,离心,10,分种,，立即将上清（,400-450l,）转移到另一离心管中。不要带入沉淀，如有则用枪头挑出。,操作程序,（,8,）,加等体积的溶液,，振荡、颠倒离心管几次以沉淀,DNA,，于室温放置分钟，小心吸取,上层水相,至另一洁净的离心管中,（为什么要用这,3,种试剂？）,。,（,9,）加入,2,倍体积,的冷的无水乙醇，室温放置分钟，,10000rpm 5min,，在管底可见微量的,DNA,沉淀，小心吸弃上清液。,（,10,）加入,1ml70%,乙醇,，将,DNA,沉淀悬浮起来后，,410000rpm,离心分钟。,（,11,）小心吸弃上清液，将离心管倒置于一张纸巾上以吸尽液体。在,室温干燥,10,分钟,。,（,12,）取,30l,灭菌水，用枪头吹达沉淀，使其,彻底,溶解，取,9l,的,DNA,样品,进行琼脂糖电泳，其余,-20,保存备用。,电泳准备,用透明胶封固玻璃板两头，在板一端放置电泳梳子。,用,1TAE,buffer,配制琼脂糖凝胶,(0.24g Agaros/32ml 1TAE,buffer),，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。待溶液冷却至,60,，加入适量溴化乙锭至微红，混匀。,将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在,5-7mm,之间。,在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有,1TAE,buffer,的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使缓冲液没过胶面。,DNA,电泳,取,9l,的,DNA,样品与,1l,的,10*,样品缓冲液混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品孔中。,盖上电泳槽并通电，使,DNA,向阳极移动。,当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离（根据,DNA,的大小、,1kb,和,3kb,左右的指示剂来判断）后，切断电源，取出玻璃板，在紫外灯下观察，并拍照记录结果，估测质粒分子量的大小。,实验要求,每组同学看到质粒条带,估算出质粒条带的分子量大小,实验报告,实验目的,实验原理,实验步骤,结果与分析,思考题,P145,（,1,），（,2,），（,3,）,下次实验,病毒的培养（鸡胚接种）,病毒的分离与培养,实验目的,理解常规的病毒培养的基本方法,掌握利用鸡胚培养病毒的原理,掌握鸡胚接种的基本路径,学会鸡胚的鉴别,病毒的种类,专性活细胞寄生,动物病毒,鸡胚接种,细胞培养,植物病毒,细菌病毒,从病料中分离病毒,一、样本的采集与处理,1,、一般原则：,合适的时间，合适的病变部位，合适的处理和保存方法,一般都要,4,保存,2,、病料的种类,动物样本：,（,1,）心、肝、肺、脾、肾脏和淋巴结等实质性器官,（,2,）各种液体病料,（,3,）肠内容物和肠壁,（,4,）皮肤病料,（,5,）骨,（,6,）脑、脊髓,植物样本：,发病植株的根、茎、叶、花、果等,；,采集病料应具有针对性：在采集病料时应有重点地采集有关脏器、内容物、分泌物、排泄物或其他材料。在无法估计病因时，可全面采集病料。进行流行病学调查、抗体检测、群体健康评估或环境卫生检测时，样品的采集数量不能太少，应具统计学意义。,B.,无菌采样：采集所用的器械、样品管等均应消毒灭菌，采集过程应保持无菌操作，不同个体、不同组织样品应作好标。,C.,采集新鲜病料：动物发病后应立即采集病料，否则，尸体腐败会影响采样和检测效果，特别是用于病理学检查的病料更应及时采集。,3,、,送检病料样本的标记,（,1,）送检病料的物种、年龄、性别、发病日期、死亡时间等。,（,2,）流行病学、临床表现、病理剖检等等初步诊断材料。,（,3,）免疫接种和用药治疗情况。,（,4,）病料中是否加有一些特殊的保护剂。,（,5,）送检的目的和要求。,（,6,）姓名和联系方式。,4,、待检病毒材料的处理：,（,1,）组织材料需经剪碎、研磨后，以汉克氏液作,1,：,10,稀释，每毫升加入青、链霉素各,1000IU,，再反复冻融,3,次，使病毒从细胞中释放出来，,3000-4000,转,/,分钟离心,20,分钟，取上清液微孔滤膜过滤后作为接种物。,（,2,）分泌物、粪便等材料则可直接以汉克氏液作,1,：,10,稀释，每毫升加入青、链霉素各,1000IU,，,4,放置过夜，,3000-4000,转,/,分钟离心,20,分钟，取上清液作为接种物。,（,3,）接种物在接种前需做细菌培养试验，只有无菌接种物才可进一步使用。,（,4,）植物样本经剪碎、研磨、离心、过滤后接种植株,鸡胚接种基本原理,鸡胚培养的优点：,鸡胚作为病毒的敏感细胞，能支持病毒完成从吸附到基因组复制，转录，蛋白质合成，装配，裂解的整个生命过程，从而使得病毒得以繁殖。,接种路径：羊膜腔，尿囊腔，绒毛尿囊膜，胚体和卵黄囊接种等,不同的病毒必须采用不同的接种路径,鸡胚培养病毒的用途：分离，繁殖，毒力测定，疫苗制备等,动物病毒,实验动物,鸡胚,多种细胞培养,接种前的准备,鸡胚的孵化,鸡胚的活力鉴别,样本的前处理,确定采用的接种路径,实验步骤,p103,1,、照蛋：,活胚：有鲜红的血管、摇动有黑点、黑点运动灵活。,死胚：血管比较暗、摇动时黑点运动不灵活,无精蛋：均匀透明、无血管和黑点,2,、划出气室,找出血管相对较少的部位,3,、消毒气室,先用碘酊棉球，在用酒精棉球脱碘,4,、打孔器打孔,在气室的斜上方中心,5,、病毒接种,灭菌注射器取,0.2,毫升病毒液（,鸡新城疫病毒,），沿孔垂直插入约,1.5,厘米进行接种（,尿囊腔接种,）,6,、石蜡封闭接种孔,（石蜡加热时温度不要太高，以防燃烧）,7,、鸡胚培养,标记后，于,37,度培养,48-72,小时,24,小时内死亡鸡胚必须剔除,8,、下次实验要验证病毒，观察鸡胚的变化,实验报告,实验目的,实验原理,实验步骤,结果与分析,思考题,p106(1),(2),(4),下次实验,质粒,DNA,的电泳、病毒的检测（血凝和血凝抑制试验）,