动物性食品中致病微生物和寄生虫的检验检疫ppt课件.ppt

动物性食品中致病微生物和寄生虫的检验检疫主要内容主要内容动物性食品中菌落总数与大肠菌群的检验动物性食品中致病菌的检验动物性食品中致病性病毒的检验动物性食品中致病性寄生虫的检验食源性疾病是世界各国面临的主要公共卫生问题之一，即便是在欧美发达国家，患食源性疾中的人群可高达30%。污染食物对人类健康构成威胁的主要因子包括化学性和生物性两大类，前者如兽药、农药和重金属，后者包括细菌、真菌及其毒素、病毒等。根据美国疾病预防与控制中心统计，在20世纪90年代由各种原因引起的食源性疾病中，细菌性占90%，化学性仅占3%。根根据据国国家家食食源源性性疾疾病病监监测测网网部部分分资资料料的的分分析析结结果果显显示示，我我国国食食源源性性疾疾病病的的高高危危食食品品依依次次为为肉肉类类、粮粮食食、海海产产品品、水水果果蔬蔬菜菜、鸡鸡蛋蛋、豆豆类类、奶奶。由由动动物物或或植植物物性性食食物物污污染染所所引引起起的的疫疫病病比比例例接接近近（约约各各占占30%30%），而而其其中中因因微微生生物物污污染染引引起起的的食食源源性性疾疾病病比比例例接接近近40%40%，远远高高于于化化学学性性食食物物中中毒毒（20%20%）。综综观观国国内内外外食食源源性性疾疾病病的的发发病病情情况况，动动物物性性食食品品中中微微生生物物污污染染是是人类食源性疾病的主要问题。人类食源性疾病的主要问题。2014年2月19日,国家食品安全风险评估中心,牵头起草的食品中致病菌限量标准，将自2014年7月1日起实施。该标准对肉制品、水产制品、粮食制品、即食果蔬制品、饮料等11大类食品分别制定了沙门氏菌等5种致病菌的限量规定，可基本满足我国食品中致病菌的控制需求，适应我国食品安全的监管需要。动物性食品易被微生物污染的原因1 食品基质 水分、丰富的营养物质2 食品的酸性3 环境条件：温度、气体、湿度动物性食品中微生物污染的可能途径主要有：动物性食品中微生物污染的可能途径主要有：食品原料本身的污染；食品原料本身的污染；动物养殖环境中的微生物对食品原料的污染；动物养殖环境中的微生物对食品原料的污染；屠宰过程中的污染；屠宰过程中的污染；深加工动物食品可能受到加工车间、加工设备表面残存微深加工动物食品可能受到加工车间、加工设备表面残存微生物污染；生物污染；食品从加工出厂、贮存、运输、销售过程中可以受到相应食品从加工出厂、贮存、运输、销售过程中可以受到相应环境中微生物的污染；环境中微生物的污染；在家庭、宾馆等厨房中生熟食品的交叉污染。在家庭、宾馆等厨房中生熟食品的交叉污染。食品微生物检测所涉及的类群食品微生物检测所涉及的类群微生物微生物非细胞生物非细胞生物细胞生物细胞生物病毒病毒原核生物原核生物真核生物真核生物细菌细菌酵母菌、霉菌酵母菌、霉菌 微生物检测程序微生物检测程序 样品的采集样品的采集注意：注意：1 所用接触样品的用具经过所用接触样品的用具经过灭菌灭菌 2 取样要均匀、特殊样品要取样要均匀、特殊样品要控制温度控制温度 3 样品采好后要贴上标签样品采好后要贴上标签（注明：样品名称、来源、（注明：样品名称、来源、数量、采样人、地点及时数量、采样人、地点及时间）间）样品的微生物检验样品的微生物检验注意：注意：1 采好的样品送检不采好的样品送检不要超过要超过3小时小时2 检完的样品的存放检完的样品的存放时间时间 3 报告的填写报告的填写 微生物对食品的污染问题是我国乃至全世微生物对食品的污染问题是我国乃至全世界食品安全中最突出的问题，我国为此数次颁界食品安全中最突出的问题，我国为此数次颁布食品微生物检验标准。按照食品安全国家标布食品微生物检验标准。按照食品安全国家标准要求，准要求，菌落总数和大肠菌群菌落总数和大肠菌群是食品企业出厂是食品企业出厂时必检的微生物指标。时必检的微生物指标。菌落总数菌落总数是指一定培养条件下（如需氧状况、培养基成是指一定培养条件下（如需氧状况、培养基成分、分、PH、培养温度和时间等）每克（每毫升）食品样品中所、培养温度和时间等）每克（每毫升）食品样品中所生长出来的细菌菌落总数。生长出来的细菌菌落总数。检测菌落总数，检测菌落总数，可以判定食品被细菌污染可以判定食品被细菌污染程度，反映出食品的新鲜程度和卫生状况程度，反映出食品的新鲜程度和卫生状况。如果某食品的菌落总数严重超标，说明其产如果某食品的菌落总数严重超标，说明其产品的卫生状况达不到基本的卫生要求，食品品的卫生状况达不到基本的卫生要求，食品将加速腐败变质，失去食用价值。将加速腐败变质，失去食用价值。小型企业，原料控制，加工车间控制不严小型企业，原料控制，加工车间控制不严第一节第一节 动物性食品中菌落总数与大肠菌群的检验动物性食品中菌落总数与大肠菌群的检验 菌落总数的检验程序菌落总数的检验程序25g(ml)样品样品+225ml生理盐水生理盐水(1:10的稀释液的稀释液)作几个适当倍数的稀释液作几个适当倍数的稀释液(例如例如1:100，1:1000)选择选择23个适宜稀释度个适宜稀释度各取各取1ml分别加入灭菌培养皿中分别加入灭菌培养皿中每个平皿中加适量（每个平皿中加适量（1520ml）营养琼脂营养琼脂菌落记数菌落记数 注意事项：注意事项：1 操作要在无菌的状态下进行。操作要在无菌的状态下进行。2 操作时间越短越好。操作时间越短越好。3 样品不同选择的稀释倍数不同。样品不同选择的稀释倍数不同。4 培养基冷却温度不宜过高或过低。培养基冷却温度不宜过高或过低。大肠菌群系指一群能发酵乳大肠菌群系指一群能发酵乳糖、需氧和兼性厌氧的革兰糖、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，包括肠氏阴性无芽孢杆菌，包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌属、柠檬杆菌属、肠杆菌属和克杆菌科的大肠埃希氏菌属、柠檬杆菌属、肠杆菌属和克雷伯菌属细菌。雷伯菌属细菌。检测大肠菌群，检测大肠菌群，可以判定食品被与粪便污染有关的细菌可以判定食品被与粪便污染有关的细菌污染的程度。污染的程度。如果某食品的大肠菌群超标，则可以推测其产如果某食品的大肠菌群超标，则可以推测其产品中存在着肠道致病菌污染的可能性，食用之可能导致食物品中存在着肠道致病菌污染的可能性，食用之可能导致食物中毒或罹患流行病。中毒或罹患流行病。第二节第二节 动物性食品中致病性细菌的检验动物性食品中致病性细菌的检验沙门氏菌沙门氏菌致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌副溶血弧菌副溶血弧菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌溶血性链球菌溶血性链球菌产单核细胞李斯特菌产单核细胞李斯特菌肉毒梭菌肉毒梭菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌空肠弯曲杆菌空肠弯曲杆菌炭疽杆菌炭疽杆菌产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌变形杆菌变形杆菌动物性食品中沙门氏菌的检验动物性食品中沙门氏菌的检验一、教学目的一、教学目的1、掌握食品中沙、掌握食品中沙门氏菌的氏菌的检验原理。原理。2、掌握食品中沙、掌握食品中沙门氏菌的氏菌的检验方法。方法。1885年沙门氏等在霍乱流行时分离到猪霍乱沙门氏菌，故定名为沙门氏菌属。沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位 二、实验原理二、实验原理（一）沙门氏菌属简介（一）沙门氏菌属简介沙沙门氏菌属是一群符合氏菌属是一群符合肠杆菌科定杆菌科定义并与其血清学相关的并与其血清学相关的革革兰氏阴性、需氧性、无芽氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种杆菌。本菌属种类繁多，抗繁多，抗原原结构复构复杂，现已已发现2000多个血清型，我国已多个血清型，我国已发现血清血清型近型近200个。个。沙沙门氏菌在水中不易繁殖，但可生存氏菌在水中不易繁殖，但可生存2-3周，周，冰箱中可生冰箱中可生存存3-4个月个月，在自然，在自然环境的境的粪便中可存活便中可存活1-2个月。沙个月。沙门氏氏菌最适繁殖温度菌最适繁殖温度为37，在，在20以上即能大量繁殖，因此，以上即能大量繁殖，因此，低温低温储存存食品是一食品是一项重要重要预防措施。防措施。沙门氏菌属沙门氏菌属生物学特性生物学特性形形态特征：特征：革革 兰 氏氏 阴阴 性性，大大 小小 为 1-30.4-0.9m的的两两端端钝圆的的短短杆杆菌菌，无无芽芽孢，一一般般无无荚膜膜，除除鸡沙沙门氏氏菌菌和和雏沙沙门氏氏菌菌以以外外，都都有有周周身身鞭鞭毛毛，运运动力力强。培养特性：培养特性：沙沙门氏菌氏菌需氧或兼性需氧或兼性厌氧氧，1042都可生都可生长，最适生，最适生长温度温度为37，最适，最适pH为6.87.8。营养养琼脂平板上：脂平板上：3537培养培养18-24h，其菌落大小一，其菌落大小一般般为23mm，光滑、湿，光滑、湿润、无色、半透明、无色、半透明、边缘整整齐。血平板上：中等大小的灰白色菌落。血平板上：中等大小的灰白色菌落。生化特性：生化特性：生化特性：生化特性：l l绝绝大多数沙大多数沙大多数沙大多数沙门门氏菌有氏菌有氏菌有氏菌有规规律的律的律的律的发发酵葡萄糖酵葡萄糖酵葡萄糖酵葡萄糖产产酸酸酸酸产产气，但也有不气，但也有不气，但也有不气，但也有不产产气气气气者，不者，不者，不者，不发发酵蔗糖和酵蔗糖和酵蔗糖和酵蔗糖和侧侧金金金金盏盏花醇、不花醇、不花醇、不花醇、不产产生生生生吲哚吲哚、不分解尿素。、不分解尿素。、不分解尿素。、不分解尿素。沙门氏菌属沙门氏菌属致病性致病性v沙沙门氏菌胃氏菌胃肠炎是由除炎是由除伤寒沙寒沙门氏菌外任何一型沙氏菌外任何一型沙门氏菌而所致，潜伏期氏菌而所致，潜伏期一般一般6-72小小时，主要症状，主要症状为恶心、呕吐、腹心、呕吐、腹绞痛、腹泻、痛、腹泻、发热寒寒颤头痛痛。病程一般病程一般12天或更天或更长。感染。感染剂量量为1520个菌，死亡率达个菌，死亡率达14%。最易。最易感群体是年幼儿童、虚弱者、年感群体是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。老人、免疫缺陷者等。v污染源主要是染源主要是人和家畜的人和家畜的粪便便，沙，沙门氏菌常存在于氏菌常存在于动物中，特物中，特别是禽是禽类和和猪。在猪。在许多多环境中也有存在。从水，土壤，昆虫中，从工厂和厨房境中也有存在。从水，土壤，昆虫中，从工厂和厨房设施的施的表面和表面和动物物粪便中已便中已发现该类细菌。它菌。它们可以可以存在于多存在于多类食品食品中，包括生中，包括生肉，禽，奶制品和蛋，肉，禽，奶制品和蛋，鱼，虾和田和田鸡腿，酵母，椰子，腿，酵母，椰子，酱油和沙拉油和沙拉调料，料，蛋糕粉，奶油蛋糕粉，奶油夹心甜点，心甜点，顶端配料，干明胶，花生露，橙汁，可可和巧克端配料，干明胶，花生露，橙汁，可可和巧克力。力。传播途径传播途径肉的污染肉的污染肉及其制品的沙门氏菌检出率美国为20%25%、英国为9.9%、日本检查进口家禽的污染率为10.3%，国内肉类沙门氏菌检出率在1.1%39.5%。蛋的污染蛋的污染中国蛋及其制品沙门氏菌检出率为3.9%-43.7%，由于吃蛋引起鼠伤寒病的病例报告逐渐有增加的趋势。环境污染环境污染食品在加工、运输、出售过程中往往被沙门氏菌污染。沙门氏菌在粪便、土壤、食品、水中可生存5个月至2年之久。2013年年6月月10日，广东东莞某工厂爆发大规模的员工食物中毒事件，日，广东东莞某工厂爆发大规模的员工食物中毒事件，100多名多名员工出现发冷、高热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等不适症状；员工出现发冷、高热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等不适症状；13日，四川眉山市一所学校日，四川眉山市一所学校386人陆续出现发烧、腹泻、呕吐症状入院救治；人陆续出现发烧、腹泻、呕吐症状入院救治；15日，广州经济技术开发区一家包装厂日，广州经济技术开发区一家包装厂76名夜班工人纷纷出现上吐下泻和发烧名夜班工人纷纷出现上吐下泻和发烧症状。症状。实验证明，沙门氏菌中毒的原因大多是因为食前未加热处理或加热不彻底。其实，沙实验证明，沙门氏菌中毒的原因大多是因为食前未加热处理或加热不彻底。其实，沙门氏菌属在门氏菌属在100时立即死亡，时立即死亡，70经经5分种，分种，65经经1520分钟，分钟，60经经1小时可被杀死。小时可被杀死。2011-08-05，美国最大的肉类加工巨头嘉吉公司，美国最大的肉类加工巨头嘉吉公司3日晚召回日晚召回3600万磅，即大约万磅，即大约1.63万吨火鸡肉。这为美国史上最大规模的召回事件。目前，美国万吨火鸡肉。这为美国史上最大规模的召回事件。目前，美国26个州已有个州已有77人感染沙门氏菌，其中一人死亡人感染沙门氏菌，其中一人死亡。不过，美国多名政府官员介绍，即使确认火。不过，美国多名政府官员介绍，即使确认火鸡肉受沙门氏菌污染，只要烹饪达到鸡肉受沙门氏菌污染，只要烹饪达到74摄氏度，仍可放心食用。摄氏度，仍可放心食用。（二）检验（二）检验 GB/T 4789.4-20031.前增菌前增菌:第一步使食物第一步使食物样品在含有品在含有营养的非养的非选择性培养基中性培养基中(缓冲蛋白冲蛋白胨水）水）增菌，使受增菌，使受损伤的沙的沙门氏菌氏菌细胞恢复到胞恢复到稳定的生理状定的生理状态。2.选择性增菌性增菌:在含在含选择性抑制性抑制剂的促生的促生长培养基中培养基中间，样品品进一步增菌的一个一步增菌的一个步步骤。此培养基允。此培养基允许沙沙门氏菌持氏菌持续增殖，同增殖，同时阻止大多数其他阻止大多数其他细菌的增殖。菌的增殖。3.选择性平板分离性平板分离:这一步采用固体一步采用固体选择性培养基，抑制非沙性培养基，抑制非沙门氏菌的生氏菌的生长，提，提供肉眼可供肉眼可见的疑似沙的疑似沙门氏菌氏菌纯菌落的菌落的识别。4.生物化学生物化学筛选:排除大多数非沙排除大多数非沙门氏菌。也提供了沙氏菌。也提供了沙门氏菌培养物菌属的初步氏菌培养物菌属的初步鉴定。定。5.血清学技血清学技术提供了培养物菌种的提供了培养物菌种的鉴定。定。三、实验仪器和材料三、实验仪器和材料1冰箱：冰箱：04。2恒温培养箱：恒温培养箱：361，42。3显微微镜：10100。4高高压灭菌器。菌器。5 超超净工作台。工作台。6 均均质器或器或灭菌乳菌乳钵。7 架架盘药物天平：物天平：0g500g,精确度精确度0.5g。8 灭菌广口瓶：菌广口瓶：500mL。9 灭菌菌锥形瓶：形瓶：500mL、250mL。10 灭菌吸管：菌吸管：10mL（具（具0.1 mL刻度）。刻度）。11 天菌培养皿：天菌培养皿：90mm。12 灭菌小菌小试管：内径管：内径3mm50mm。13 灭菌毛菌毛细管。管。四、培养基和试剂四、培养基和试剂1缓冲蛋白冲蛋白胨水水(BP)2氯化化镁孔雀孔雀绿(MM)增菌液增菌液3四硫酸四硫酸钠煌煌绿(TTB)增菌液增菌液4亚硒酸硒酸盐胱氨酸胱氨酸(SC)增菌液增菌液5亚硫酸硫酸铋琼脂脂(BS)6DHL琼脂脂7HE琼脂：按脂：按GB/T 4789.282003中中4.21规定。定。8TSI琼脂脂9蛋白蛋白胨水、靛基水、靛基质试剂10 尿素尿素琼脂脂(pH7.2)11 氨基酸脱氨基酸脱羧酶试验培养基培养基12 沙沙门氏菌因子血清：按氏菌因子血清：按26种用于初步分型；种用于初步分型；57种用于种用于进一步分型；一步分型；163种用于种用于详细分型。分型。五、检验样品五、检验样品1 鲜猪肉、猪肉、鲜牛肉；牛肉；冻猪肉猪肉2 鲜牛奶、牛奶、鲜鱼；冻鱼3 香香肠、虾仁仁六、沙门氏菌检验流程六、沙门氏菌检验流程 检样前增菌法前增菌法直接增菌法直接增菌法冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品肉、蛋品、乳品及其它加工食品鲜肉、肉、鲜蛋、蛋、鲜乳及其它未乳及其它未经加工的食品加工的食品25g BP 225mL 25g 灭菌生理菌生理盐水水25mL 制成制成检样均均质液液（361）一般一般 4 h，干蛋品，干蛋品 1824 h10mLMM(或或TTB)100mL 10mLSC 100mL 检样均均质液的半量液的半量MM(或或TTB)100mL 检样均均质液的半量液的半量SC 100mL 42 1824 h （361）1824 h 42 1824 h （361）1824 h BS DHL(或或HE、WS、SS)（361）4048 h （361）1824 h 挑取可疑菌落挑取可疑菌落TSI（斜面、底（斜面、底层、产气、气、H2S）、蛋白）、蛋白胨水（靛基水（靛基质）、尿素（）、尿素（pH7.2）、）、KCN、赖氨酸氨酸H2S靛基靛基质H2S靛基靛基质H2S靛基靛基质非如左述的非如左述的尿素尿素KCN赖氨酸氨酸尿素尿素KCN赖氨酸氨酸尿素尿素KCN赖氨酸氨酸/各种反各种反应结果果 甘露醇、山梨醇甘露醇、山梨醇ONPG 沙沙门氏菌血清学氏菌血清学实验沙沙门氏菌血清学氏菌血清学实验非沙非沙门氏菌氏菌非沙非沙门氏菌氏菌 报告告 七、操作步骤七、操作步骤 1、前增菌和增菌、前增菌和增菌冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品肉、蛋品、乳品及其他加工食品均均应经过前增菌。以无菌操作取前增菌。以无菌操作取25g（mL），加在装有），加在装有225mL缓冲蛋白冲蛋白胨水的水的500mL广口瓶内。固体食广口瓶内。固体食品可先品可先应用均用均质器以器以8000 10000r/min打碎打碎1min，或用乳，或用乳钵加加灭菌砂磨菌砂磨碎，粉状食品用碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于菌匙或玻棒研磨使乳化，于361培养培养4h(干蛋品培干蛋品培养养18h24h)，移取，移取10mL，转种于种于100mL氯化化镁孔雀孔雀绿增菌液或四硫酸增菌液或四硫酸钠煌煌绿增菌液内，于增菌液内，于42培养培养18h 24h。同。同时，另取，另取10mL，转种于种于100mL亚硒酸硒酸盐胱氨酸增菌液内，于胱氨酸增菌液内，于361培养培养18h24h。鲜肉、肉、鲜蛋、蛋、鲜乳或其他未乳或其他未经加工的食品加工的食品不必不必经过前增菌。前增菌。各取各取25g(25mL)加入加入灭菌生理菌生理盐水水25mL，按前法做成，按前法做成检样匀液；取匀液；取25mL，接种于，接种于100mL氯化化镁孔雀孔雀绿增菌液或四硫增菌液或四硫磺酸磺酸钠煌煌绿增菌液内，于增菌液内，于42培养培养24h；另取；另取25mL接种于接种于100mL亚硒酸硒酸盐胱氨酸增菌液内，于胱氨酸增菌液内，于361培养培养18h24h。2、分离、分离取增菌液取增菌液1环，划，划线接种于一个接种于一个亚硫酸硫酸铋琼脂平板和一个脂平板和一个DHL琼脂平板脂平板(或或HE琼脂平板、脂平板、WS或或SS琼脂平板脂平板)。两种增菌液可同。两种增菌液可同时划划线接种在同一个平板上。于接种在同一个平板上。于361分分别培养培养18h24h(DHL、HE、WS、SS)或或40h48h(BS)，观察各个平板上生察各个平板上生长的菌落。的菌落。沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征沙门氏菌属各群在各种选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性性琼脂平板脂平板沙沙门氏菌氏菌、沙沙门氏菌氏菌（即（即亚利桑那菌）利桑那菌）BS琼脂脂产硫化硫化氢菌落菌落为黑色黑色带有金属光有金属光泽，棕，棕褐色或灰色，菌落周褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不或棕色；有些菌株不产生硫化生硫化氢，形成，形成灰灰绿色的菌落，周色的菌落，周围培养基不培养基不变黑色黑色带有金属光有金属光泽 DHL琼脂脂无色半透明，无色半透明，产硫化硫化氢菌落中心菌落中心带黑色黑色或几乎全黑色或几乎全黑色乳糖乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与阳性或阴性的菌株与亚属属、相同；乳相同；乳糖阳性的菌株糖阳性的菌株为粉粉红色，中心色，中心带黑色黑色 HE琼脂脂WS琼脂脂蓝绿色或色或蓝色；多数菌株色；多数菌株产硫化硫化氢，菌，菌落中心黑色或几乎全黑色落中心黑色或几乎全黑色乳糖阳性的菌株乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑黄色，中心黑色或几乎全黑色；乳糖色或几乎全黑色；乳糖迟缓阳性阳性或阴性的菌株或阴性的菌株为蓝绿色或色或蓝色，色，中心黑色或几乎全黑色中心黑色或几乎全黑色 SS琼脂脂无色半透明，无色半透明，产硫化硫化氢菌株，有的菌落菌株，有的菌落中心中心带黑色，但不如以上培养基明黑色，但不如以上培养基明显乳糖乳糖迟缓阳性或阴性的菌株与阳性或阴性的菌株与亚属属、相同；乳相同；乳糖阳性的菌株糖阳性的菌株为粉粉红色，中心黑色，中心黑色，但中心无黑色形成色，但中心无黑色形成时与大与大肠埃希氏菌不能区埃希氏菌不能区别 3、生化、生化试验自自选择性性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三接种三糖糖铁琼脂、蛋白脂、蛋白陈水水(供做靛基供做靛基质试验)、尿素、尿素琼脂脂(pH7.2)、氰化化钾(KCN)培养基和培养基和赖氨酸脱竣氨酸脱竣酶试验培养基及培养基及对照培养基各照培养基各1管，于管，于361培养培养18h24h，必要，必要时可延可延长至至48h，按生化，按生化反反应初步初步鉴定表判定定表判定结果。按反果。按反应序号分序号分类，沙，沙门氏菌属的氏菌属的结果果应属于属于A1、A2和和B1，其他，其他5种反种反应结果均可以排除。果均可以排除。肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果肠杆菌科各属在三糖铁琼脂内的反应结果 斜面斜面底底层产气气硫化硫化氢可能的菌属和种可能的菌属和种/沙沙门氏菌属、弗氏菌属、弗劳地氏地氏柠檬酸檬酸杆菌、杆菌、变形杆菌属、形杆菌属、缓慢慢爱德德华氏菌氏菌/沙沙门氏菌氏菌、弗、弗劳地氏地氏柠檬酸檬酸杆菌、普通杆菌、普通变形杆菌形杆菌沙沙门氏菌属、大氏菌属、大肠埃希氏菌、埃希氏菌、蜂蜂窝哈夫尼哈夫尼亚菌、摩根氏菌，菌、摩根氏菌，普普罗菲登斯菌属菲登斯菌属伤寒沙寒沙门氏菌，氏菌，鸡沙沙门氏菌、氏菌、志志贺氏菌属、大氏菌属、大肠埃希氏菌、埃希氏菌、蜂蜂窝哈夫尼哈夫尼亚菌、摩根氏菌，菌、摩根氏菌，普普罗菲登斯菌属菲登斯菌属/大大肠埃希氏菌、埃希氏菌、肠杆菌属、克杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、弗劳地氏地氏柠檬酸杆菌檬酸杆菌注：阳性；阴性；注：阳性；阴性；/多数阳性，少数阴性多数阳性，少数阴性肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表 反反应序号序号硫化硫化氢（H2S）靛基靛基质pH7.2尿素尿素氰化化钾（KCN）赖氨酸脱氨酸脱羧酶判定判定结果果A1沙沙门氏菌属氏菌属A2沙沙门氏菌属（少氏菌属（少见）缓慢慢爱德德华氏菌氏菌A3弗弗劳地氏地氏柠檬酸杆菌、奇异檬酸杆菌、奇异变形杆菌形杆菌A4普通普通变形杆菌形杆菌B1沙沙门氏菌属、大氏菌属、大肠埃希氏埃希氏菌、甲型副菌、甲型副伤寒沙寒沙门氏菌氏菌大大肠埃希氏菌、志埃希氏菌、志贺氏菌属氏菌属B2大大肠埃希氏菌埃希氏菌大大肠埃希氏菌、志埃希氏菌、志贺氏菌属氏菌属B3/克雷伯氏菌族各属阴沟克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆杆菌、弗菌、弗劳地氏地氏柠檬酸杆菌檬酸杆菌B4/摩根氏菌，普摩根氏菌，普罗菲登斯菌属菲登斯菌属注注1：三糖：三糖铁琼脂底脂底层均均产酸，不酸，不产气者可排除；斜面气者可排除；斜面产酸与酸与产气与否均不限。气与否均不限。注注2：KCN和和赖氨酸可氨酸可选作其中一作其中一项，但不能判定，但不能判定结果果时，仍需，仍需补做另一做另一项。注注3：表示阳性；表示阴性；：表示阳性；表示阴性；/表示多数阳性，少数阴性。表示多数阳性，少数阴性。沙门氏菌检验沙门氏菌检验几点注意几点注意冷冷冻样品品解解冻需需在在45以以下下，有有自自动调温温器器自自控控的的水水浴浴锅内内不不断断搅拌拌进行行15min或在或在2-8，18小小时内内软化。化。为保保证检验的的准准确确性性，必必须在在选择性性培培养养基基上上挑挑取取足足够数量的菌落数量的菌落进行生化和血清学行生化和血清学鉴定。定。进行行生生化化反反应时，应以以纯培培养养物物进行行试验，如如出出现血血清清学学阳阳性性，而而生生化化反反应特特征征不不符符合合时，应对接接种种物物进行行纯化化，用用纯化化后后的的培培养养物物重重新新进行行生化生化试验。测试中中应同同时接种阳性接种阳性对照菌株。照菌株。金黄色葡萄球菌细菌学及其检验 v自自然然分分布布：金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌分分布布广广泛泛，存存在在于于环环境境、空空气气、水水、牛牛奶奶、食食品品、污污水水及及人人和和动动物物等等。与与人人关关系系密密切切，构构成成人人体体皮皮肤肤、鼻鼻腔腔、咽咽部部等等处处的的正正常常细细菌菌群群，对对人人有有致致病病性性，是是临临床床医医学学中中常常见见的的化化脓脓性性球球菌菌之之一一，也也是是污污染染食食品品造造成成食食物中毒的细菌之一。物中毒的细菌之一。1 生物学性状 形形态态与与染染色色：典典型型金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌呈呈球球形形，直直径径0.51.0微微米米，较较非非致致病病性性葡葡萄萄球球菌菌略略小小，各各个个菌菌体体的的大大小小及及排排列列较较整整齐齐。细细菌菌繁繁殖殖时时呈呈多多个个平平面面的的不不规规则则分分裂裂，堆堆积积成成葡葡萄萄串串状状排排列列。在在脓脓汁汁或或液液体体培培养养基基中中生生长长，常常呈呈双双球球或或短短链链排排列列，易易误误为为链链球球菌菌。金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌无无鞭鞭毛毛，故故不不能能自自由由移移动动，一一般般不不形形成成荚荚膜膜，不不产产生生芽芽孢孢。革革兰兰氏氏染染色色为为阳阳性性，衰衰老老、死死亡亡或或被被白白细细胞胞吞吞噬噬的的菌菌体体，常常转转呈呈革革兰兰氏氏阴阴性性，故故须须注意。注意。培培养养特特性性：本本菌菌为为需需氧氧或或兼兼性性厌厌氧氧，对对营营养养要要求求不不高高，在在普普通通培培养养基基上上生生长长良良好好，最最适适宜宜生生长长温温度度为为37，最最适适宜宜pH为为7.4，耐耐盐盐性性强强，在在含含10-15%氯氯化化钠钠培培养养基基中中能能生生长长，利利用用这这一特性，可有利于金葡菌的检出。一特性，可有利于金葡菌的检出。在在普普通通琼琼脂脂培培养养基基上上形形成成圆圆形形、凸凸起起、表表面面光光滑滑、湿湿润润、边边缘缘整整齐齐、不不透透明明的的菌菌落落。直直径径一一般般为为1-2mm，密密集集生生长长的的菌菌落落较较小小，稀稀散散或或生生长长较较久久着着，直径可达直径可达4-5mm。在在普普通通肉肉汤汤培培养养基基中中生生长长迅迅速速，一一般般呈呈均均匀匀混混浊浊生生长长，如如培培养养基基中中的的糖糖类类被被分分解解后后，产产生生较较多多的的酸酸性性物物质质即即可可发发生生酸酸性性沉沉淀淀。培培养养时时间间较较长长，2-3日日后常有菌膜形成而出现粘性沉淀后常有菌膜形成而出现粘性沉淀在在血血琼琼脂脂平平板板上上形形成成较较大大菌菌落落，有有色色素素产产生生，由由于于本本菌菌产产生生的的色色素素为为脂脂溶溶性性不不溶溶于于水水，故故色色素素只只局局限限于于菌菌落落内内，不不透透入入培培养养基基中中。该该菌菌产产生生溶溶血血毒毒素素，使使菌菌落落周周围围红红细细胞胞溶溶解解而而形形成成透透明明的的溶溶血血环环，非致病性葡萄球菌无此现象。非致病性葡萄球菌无此现象。在在Bairdparker琼琼脂脂平平板板上上，菌菌落落呈呈圆圆形形凸凸起起，表表面面光光滑滑湿湿润润，直直径径23mm，灰灰黑黑色色至至黑黑色色，有有光光泽泽，常常有有浅浅色色的的边边缘缘，周周围围绕绕以以不不透透明明圈圈，其其外外常常有有一一清清晰晰带带，菌菌落落有有黄黄油油样样粘粘稠稠感感。从从长长期期贮贮存存的的冷冷冻冻或或脱脱水水食食品品中中分分离离的的菌菌落落，其其黑黑色色常常较较典典型型菌菌落落浅浅些些，且且外外观可能较粗糙，质地较干燥。观可能较粗糙，质地较干燥。抵抵抗抗力力：葡葡萄萄球球菌菌抵抵抗抗力力较较强强，在在干干燥燥的的脓脓汁汁中中能能存存活活数数月月，有有些些菌菌株株需需加加热热803060分分钟钟才才被被杀杀死死。在在5%石石炭炭酸酸中中15分分钟死亡。钟死亡。2 致病性致病性金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌为为潜潜在在性性的的病病原原菌菌，它它所所产产生生的的多多种种胞胞外外蛋蛋白白质质对对人人和和动动物物组组织织有有害害，其其中中一一类类是是各各种种酶酶类类，如如脂脂酶酶、蛋蛋白白酶酶、青青霉霉素素酶酶、凝凝固固酶酶和和耐耐热热DNA酶酶等等，另另一一类类为为毒毒素素，它它们们是是溶溶血血素素（、）、溶溶白白细细胞胞素素、肠肠毒毒素素（A、B、C、D、E、TSS）及及化脓性毒素等。化脓性毒素等。2 致病性致病性 虽虽然然人人体体对对金金葡葡菌菌感感染染具具有有一一定定的的抵抵抗抗力力，但但当当机机体体抵抵抗抗力力下下降降或或皮皮肤肤粘粘膜膜受受损损时时易易被被感感染染，可可引引起起局局部部或或全全身身炎炎症症，侵侵入入血血流流可可引引起起败败血血症症及及脓脓毒毒血血症症。金金葡葡菌菌污污染染食食品品之之后后可可能能产产生生大大量量的的肠肠毒毒素素，肠肠毒毒素素是是该该菌菌引引起起食物中毒的主要因素之一。食物中毒的主要因素之一。金金葡葡菌菌肠肠毒毒素素具具有有极极强强的的稳稳定定性性，能能抵抵抗抗许许多多蛋蛋白白酶酶的的消消化化，只只有有在在小小于于pH2的的条条件件下下蛋蛋白白酶酶才才能能使使其其失失去去活活性性。这这一一点点可可以以解解释释，为为什什么么摄摄入入肠肠毒毒素素在在胃胃中中有有蛋蛋白白酶酶时时，仍仍然然引引起起食食物物中中毒毒，因因为为胃胃液液的的酸酸度度大大于于pH2，所所以以不不能能消消化化肠肠毒毒素素。肠肠毒毒素素还还相相当当耐耐热热，经经煮煮沸沸30分分钟钟后后仍仍不不能能完完全全破破坏坏其其毒毒性性。当当含含肠肠毒毒素素为为20/ml 的的牛牛肉肉汤汤（pH6.2），在在121 加加热热需需要要37分钟以上，才能灭活毒素。分钟以上，才能灭活毒素。金金葡葡菌菌肠肠毒毒素素的的产产生生因因菌菌株株不不同同而而有有所所差差异异，有有资资料料显显示示，食食品品中中存存在在的的金金葡葡菌菌几几乎乎都都产产生生肠肠毒毒素素。以以往往认认为为凝凝固固酶酶阳阳性性的的金金葡葡菌菌能能产产生生肠肠毒毒素素，但但不不是是都都产产生生肠肠毒毒素素。后后有有实实验验证证实实，有有些些产产生生肠肠毒毒素素的的金金葡葡菌菌株株产产生生耐耐热热DNA酶酶却却不不产产生生凝凝固固酶酶，即即一一些些凝凝固固酶酶阴阴性性菌菌株株也也产产生生肠肠毒毒素素，要要鉴鉴定定是是否否是是产产毒毒株株，需需同同时时进进行行凝凝固固酶酶和和耐耐热热DNA酶酶测测定定试试验验。而而耐耐热热DNA酶酶和和肠肠毒毒素素的的耐耐热热力力相相近近似似，由由此此可可见见耐耐热热DNA酶酶的的产产生生与与肠肠毒毒素素的的关关系系较较凝凝固固酶酶更更为为平平行行。所所以以常常用用耐耐热热DNA 酶酶试试验验代代替替肠肠毒毒素素测测定定。自自1982年年起起有有些些国国家家就就提提出出进进口口方方便便食食品品中中不不得得检检出出含含有有耐耐热热DNA酶酶的的金金葡葡菌。菌。“金球菌金球菌”列为列为“极重要质量项目极重要质量项目”2011年11月，“思念”、“三全”和“湾仔码头”等国内速冻食品知名品牌相继被检出金黄色葡萄球菌超标后，使得速冻食品行业陷入“细菌门”。卫生部于2012年12月21日实施的速冻面米制品食品安全国家标准，将金黄色葡萄球菌检测由定性转向定量，规定每批产品抽检5个样品中，至多只能有1个样品每克生制品中检出的金黄色葡萄球菌含量在1000至10000个之间结核分枝杆菌分枝杆菌属分枝杆菌属Mycobacterium一类直或微弯曲的杆菌，有分枝生长趋势，可呈丝一类直或微弯曲的杆菌，有分枝生长趋势，可呈丝状或菌丝样生长。细胞壁脂质含量高（分枝菌酸），状或菌丝样生长。细胞壁脂质含量高（分枝菌酸），耐酸，抗酸染色阳性。对氧和营养要求高，生长慢。耐酸，抗酸染色阳性。对氧和营养要求高，生长慢。不产生毒素和侵袭酶类，引起慢性疾病。不产生毒素和侵袭酶类，引起慢性疾病。又称又称抗酸杆菌抗酸杆菌(acid-fast bacillus)-不易着色，可抵抗盐酸酒精的不易着色，可抵抗盐酸酒精的脱色作用脱色作用分类属放线菌科，本属有分类属放线菌科，本属有80多种，可分三类：多种，可分三类：结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌。结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌。细菌的细菌的DNA G+Cmol%为为6270 临床标本临床标本 抗酸染色抗酸染色+L-J分离培养分离培养 +7天天 +7天天 缓生菌缓生菌 速生菌速生菌 PNB +-T2H +-非典型分枝杆菌非典型分枝杆菌 人型结核分枝杆菌人型结核分枝杆菌 牛型分枝杆菌牛型分枝杆菌 光反应性试验光反应性试验 光产色菌光产色菌 暗产色菌暗产色菌 不产色菌不产色菌 分枝杆菌的鉴定程序分枝杆菌的鉴定程序 结核分枝杆菌结核分枝杆菌一、分类一、分类结核分枝杆菌结核分枝杆菌（MycobacteriumMycobacteriumTuberculosisTuberculosis，TBTB）复合群：）复合群：人结核分枝杆菌人结核分枝杆菌(M.tM.tuberculosis)uberculosis)牛分枝杆菌牛分枝杆菌(M.bovis)(M.bovis)非洲分枝杆菌非洲分枝杆菌 田鼠分枝杆菌田鼠分枝杆菌二、细菌特性二、细菌特性形态染色形态染色 TBTB菌细长略弯曲，有时可见菌细长略弯曲，有时可见分枝分枝，呈单、成堆或，呈单、成堆或成束成束排列，无鞭毛、无排列，无鞭毛、无芽胞，芽胞，有荚膜有荚膜。可出现多形性，在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典。可出现多形性，在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等。型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等。TBTB菌菌革兰染色阳性革兰染色阳性。培养特性培养特性 专性需氧菌专性需氧菌，3%3%5%5%的的CO2CO2能促进生长。最适能促进生长。最适ph 6.56.8，最适温度为，最适温度为37，低于，低于3030难生长，难生长，营养要求高营养要求高，在，在含有蛋黄、马钤薯、甘油和天门冬素等的固体培养基上才能含有蛋黄、马钤薯、甘油和天门冬素等的固体培养基上才能生长，且生长，且生长缓慢生长缓慢。固体培养基固体培养基-典型菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒状、典型菌落为干燥、坚硬、表面呈颗粒状、乳酪色或淡黄色，乳酪色或淡黄色，形似菜花样形似菜花样形似菜花样形似菜花样。液体培养基液体培养基-生长较快呈粗糙皱纹状菌膜生长，生长较快呈粗糙皱纹状菌膜生长，有毒株可有毒株可 呈索状生长呈索状生长（吐温干扰）（吐温干扰）。菜花样菌落菜花样菌落生化反应生化反应 生化不活泼。不发酵糖类，生化不活泼。不发酵糖类，多数菌株触酶阳性，热触酶多数菌株触酶阳性，热触酶阴性，非结核分枝杆菌正好相反。阴性，非结核分枝杆菌正好相反。结核分枝杆菌烟酸和硝酸盐试验阳性，耐噻吩结核分枝杆菌烟酸和硝酸盐试验阳性，耐噻吩2羧酸羧酸肼肼(T2H)，牛型则相反。有毒株中性红试验阳性。，牛型则相反。有毒株中性红试验阳性。变异性变异性 TB菌易发生形态、菌落、最适生长温度、毒力和耐药性的变异。如卡菌易发生形态、菌落、最适生长温度、毒力和耐药性的变异。如卡介苗、介苗、Much颗粒和多重耐药菌株出现等。颗粒和多重耐药菌株出现等。抵抗力抵抗力 TBTB菌细胞壁含大量脂类，抵抗力较强菌细胞壁含大量脂类，抵抗力较强 干痰中存活干痰中存活6-86-8个月，粘附尘埃上保持传染性个月，粘附尘埃上保持传染性8-108-10天。天。3%HCL或或4%NaOH、6%H2SO4溶液中能耐受溶液中能耐受3030分钟分钟 常以常以酸碱中和处理严重污染的检材，杀死杂菌和消化粘稠物质酸碱中和处理严重污染的检材，杀死杂菌和消化粘稠物质，提高检出率提高检出率 对一定浓度的孔雀绿有抵抗力。对一定浓度的孔雀绿有抵抗力。对湿热、紫外线、酒精的抵抗力弱。对湿热、紫外线、酒精的抵抗力弱。(如在液体中加热如在液体中加热6030分钟，直射日光下分钟，直射日光下23小时，小时，75%酒精酒精内数分钟即死亡。内数分钟即死亡。)三、临床意义三、临床意义TBTB菌引起结核病。菌引起结核病。对人类致病的有人结核分枝杆菌、牛型结核杆菌和对人类致病的有人结核分枝杆菌、牛型结核杆菌和非洲分枝