血清学试验.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,动物微生物,血清学诊断,动物微生物,血清学试验的概念,由于抗体主要存在于血清中，所以将体外发生的抗原抗体结合反应称为血清学反应或血清学试验。,动物微生物,血清学试验的特点,特异性和交叉性,敏感性,可逆性,反应的二阶段性,最适比例与带现象,用已知测未知,动物微生物,特异性和交叉性,特异性,抗原只能与相应抗体结合，而不能与其他抗体相结合。,交叉性,两种不同的抗原之间含有共同的抗原决定簇，则发生交叉反应。,动物微生物,反应的二阶段性,第二阶段,抗原抗体复合物出现可见反应阶段。此阶段反应慢、需数分钟、数十分钟或更久第一阶段,抗原与抗体的特异性结合阶段，此阶段反应快、仅数秒至数分钟，但不出现可见反应。,动物微生物,敏感性,抗原抗体的结合还具有高度敏感性的特点，不仅可检测定性，还可以定量检测微量、极微量的抗原或抗体。,动物微生物,最适比例与带现象,抗原与抗体结合，其比例适当时才可出现肉眼可见反应。抗体除,IgM,是,5,价，,SIgA,4,价外，一般抗体都含有两个结合位点（二价）；抗原则根据分子大小，有,10,50,个不等的结合点。当抗原抗体比例适当时，两者结合后，尚有未饱和的结合点，可以继续与游离的抗体、抗原或与抗原抗体结合物的未饱和点相联结，逐渐形成愈来愈大的复合物，出现了肉眼可见反应。比例最适合，出现反应最快，反应产物愈多。,如果抗原或抗体过多，抗体和抗原结合点的聚合一开始时即达到饱和，形成小的复合物则不能继续与相邻抗原、抗体结合，不出现可见反应，谓之带现象。,前带,后带,动物微生物,可逆性,抗原与抗体的结合是分子表面的结合，这种结合是可逆的，结合条件为,0,40,、,pH4,9,。如温度超过,60,或,pH,降到,3,以下，或加入解离剂时，则抗原抗体复合物又可重新解离，并且分离后抗原或抗体的性质仍不改变。,动物微生物,用已知测未知,所有的血清学试验都是用已知抗原测定未知抗体，或用已知抗体测定未知抗原。,动物微生物,影响血清学试验的因素,电解质：,血清学反应须在适当浓度的电解质参与下，才出现可见反应。,0.9%,氯化钠溶液。,8-10%,温度：,在一定温度范围内，温度越高，抗原、抗体分子运动速度越快，这可以增加其碰撞的机会，加速抗原抗体结合和反应现象的出现。,动物微生物,酸碱度：,血清学反应通常用,pH6,8,，过酸或过碱都可使复合物解离，,pH,值在等电点时，可引起非特异凝集。,振荡：,适当的机械振荡能增加分子或颗粒间的相互碰撞，加速抗原抗体的结合反应，但强烈的振荡可使抗原抗体复合物解离。,杂质和异物：,试验介质中如有与反应无关的杂质、异物存在时，会抑制反应的进行或引起非特异性反应。,动物微生物,血清学试验的类型,凝集试验,沉淀试验,补体结合试验,中和试验,免疫标记技术,动物微生物,凝集试验的概念,细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在红细胞、乳胶等颗粒性载体表面的可溶性抗原，与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，经过一定时间，复合物互相凝聚形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验。,动物微生物,凝集试验的类型,直接凝集试验,间接凝集试验,动物微生物,直接凝集试验,概念：颗粒性抗原与相应抗体在电解质的参与下，直接结合，凝集成团的现象，称直接凝集试验。,类型：按其操作方法可分为,玻片法,和,试管法。,动物微生物,1,玻片凝集试验,方法：,在玻璃板或瓷片上进行。,特点：简单、快速。,用途：,定性试验，如,细菌鉴定、血型鉴定等。,动物微生物,2,试管凝集试验,方法：在试管中进行。,特点：准确、耗时。,用途：定量试验，如诊断布氏杆菌病，测定抗体的凝集价。,结果判定,结果用“,+”,表示反应强度。,+,：液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底。,+,：液体透明，菌体基本被凝集沉于管底。,+,：液体不甚透明，管底有明显的凝集沉淀。,+,：液体透明度不明显或不透明，有不明显的沉淀或有沉淀的痕迹。,：液体不透明，呈均匀混浊，管底无凝集。有时有少量菌体集中于管底中心，呈脐状，但振摇时，立即散开呈均匀浑浊。,以出现“,+”,的最高血清稀释倍数即为该份血清的效价，又叫凝集价。大动物（马，牛，骆驼等）以凝集价,1,：,100,以上判为阳性，,1,：,50,的凝集价判为可疑。中小动物（猪，羊，狗等）以凝集价,1,：,50,以上判为阳性，,1,：,25,的凝集价判为可疑。,如对照管不符合要求时，试管须废弃重做。,动物微生物,间接凝集试验,概念：,将可溶性抗原或抗体,与载体连接后，再与相应的抗体或抗原作用，所出现的特异性凝集反应为间接凝集试验。,类型：,间接血凝试验,乳胶凝集试验,协同凝集试验,动物微生物,致敏红细胞,红细胞,抗原,红细胞,抗原,致敏红细胞,被检抗体,红细胞凝集,间接血凝试验原理,凝集强度判定,（,100%,红细胞凝集）：边缘不整齐，有红色颗粒布满孔底）,（,50%,红细胞凝集）,V,型孔：孔底可见红色颗粒，中央有少量红细胞沉淀,红细胞呈点状沉于孔底，无红色颗粒。,能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数，为该病毒的红细胞凝集滴度，即一个凝集单位。如表,18-1-1,的病毒血凝滴度为,2,7,，即将病毒原液作,2,7,倍稀释，其中含一个血凝单位的病毒。,由于病毒血凝抑制试验中需要的病毒液应含,4,个血凝单位，因此，需要对原病毒液进行,2,5,倍稀释。,以能使,100%,红细胞不发生凝集的血清最大稀释倍数为该血清的,HI,滴度，以,2,的指数表示。,动物微生物,沉淀试验的概念,可溶性抗原与相应的抗体结合，在适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验。,动物微生物,沉淀试验的类型,环状沉淀试验,琼脂凝胶扩散试验,免疫电泳动物微生物,环状沉淀试验,方法：在小口径试管中进行。,原理：试管内，下层沉淀素与上层沉淀原在液界面应形成白色沉淀环。,用途：主要用于抗原的定性试验，如炭疽杆菌的,Ascoli,试验,、,链球菌的血清型鉴定、血迹鉴定等。,白色沉淀环,沉淀原,沉淀素,动物微生物,琼脂凝胶扩散试验,原理,1%,琼脂凝胶孔径为,85nm,，能使许多可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散。当抗原与抗体在凝胶中的一定位置上相遇时，则两者结合形成沉淀线。,动物微生物,琼脂凝胶扩散试验类型,单向单扩散,单向双扩散,双向单扩散,双向双扩散,方法,用途,动物微生物,双向双扩散方法,此法系采用,1%,琼脂倒于平皿或玻片上，制成凝胶板，可按需要打孔。将抗原、抗体分别滴入孔内，放置湿盒中，在,37C,湿箱中,24-72h,后观察。,动物微生物,双向双扩散用途,抗原的比较和鉴定：在抗原与抗体孔间形成沉淀带。每一种抗原成分出现一条沉淀带。如两个相邻孔之间抗原相同，则沉淀带融合，如,1,、,2,；抗原不同，则互相交叉，如,3,；部分相同则部分融合，另外不同部分则交叉，如,4,。,动物微生物,免疫电泳,免疫电泳技术是把凝胶扩散试验与电泳技术相结合的免疫检测技术。即将琼脂扩散置于直流电场中进行，让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其扩散方向，在比例合适处形成可见的沉淀带。,动物微生物,补体结合试验,试验系统、,原理,和结果判定,反应系统,已知抗原（抗体）,待检血清（抗原）,补体,绵羊红细胞,溶血素,如溶血则为阴性,如不溶血则为阳性,指示系统,反应结果的判定,动物微生物,动物微生物,中和试验,概念：根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验。,原理：病毒与抗血清中抗体特异结合后失去感染易感动物、鸡胚或细胞活性。,举例,IBDV,9,11d,鸡胚,24,48h,鸡胚死亡,IBDV,+,抗血清,9,11d,鸡胚 鸡胚不死亡,动物微生物,免疫标记技术,抗原与抗体结合了，但复合物小，不能通过凝集或沉淀用肉眼观察到。,该怎么办？,将抗体或抗原联结在一个特定的易于检测的物质上，通过,检测特定物质的存在，间接反映抗原抗体发生了结合,。,动物微生物,荧光抗体标记技术,原理：将荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合后，用荧光显微镜观察所标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。,荧光素：荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。最常用的是异硫氰酸荧光素,(FITC),。,动物微生物,荧光抗体染色,染色方法,抗补体法,直接法,间接法,抗原,抗体,荧光素,抗抗体,抗补体抗体,动物微生物,酶标抗体技术,原理：,将酶分子标记在抗体或抗原分子上，利用抗原抗体反应的特异性及酶的高催化活性进行检测。,用于标记的酶：辣根过氧化物酶（,HRP,）、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。,动物微生物,免疫酶组织化学染色技术,酶联免疫吸附试验,斑点,-,酶联免疫吸附试验,酶标抗体技术分类,动物微生物,酶联免疫吸附试验,试验方法,间接法：用于测定抗体,夹心法：用于测定大分子抗原,双夹心法：用于测定大分子抗原,原理,通过化学方法将酶与抗体结合起来。酶标记后的抗体仍然保持着能与相应抗原结合的免疫学活性及酶的催化活性。酶标抗体与抗原结合后，形成酶标抗体,-,抗原复合物。复合物上的酶，在遇到相应的底物时，催化底物分解，使底物中的供氧体由无色的还原型变成有色的氧化型，呈现颜色反应，,用肉眼或酶标仪判定结果。,动物微生物,目前已广泛于应用多种细菌病和病毒病的诊断和检测。如猪传染性胃肠炎、鸡新城疫、牛传染性鼻气管炎、猪伪狂犬病、蓝舌病、蓝耳病、猪瘟、口蹄疫等传染病的诊断和抗体监测常用此技术。,酶联免疫吸附试验应用,方法：,1.,样本稀释,2.,加样,3.,温育,4.,洗涤,5.,加酶标二抗,6.,温育,7.,洗涤,8.,加底物,9.,避光显色,10.,终止反应,11.,结果测定,