第四章生物免疫分析技术.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章生物免疫分析技术,免疫学方法在食品分析中正得到越来越广泛得运用,其中酶联免疫吸附法(,ELISA,)已经在食品工业中广泛应用,她能够用于测定人们希望含有得物质,以及不希望含有得物质。例如现在人们所关注得食品安全性问题中一些物质得检测:杀虫剂、药物残留物、激素、生长素、微生物毒素、真菌毒素或肠毒素、天然毒素,以及一些添加剂。,免疫分析法具备有效得灵敏度、特异性、快速和低成本得优点;可对大量得样品进行常规分析;能够用于样品得定性筛选,也能够对样品进行定量测定以确定样品中待测组分得含量。,4、1 免疫得原理,Ag +Ab AgAb,特异性、灵敏性,在Ag,Ab反应中,用容易示踪得化学物质标记一种反应物,以了解反应就是否发生,发生部位,以及发生得程度(即对未知成分得样品进行定性、定位及定量分析)。,4、2 酶联免疫法,免疫酶技术:把抗原抗体得免疫反应和酶得高效催化作用原理有机地结合起来。她具有免疫荧光试验和放射免疫试验得优点,并克服上述两种方法得缺点。,酶标记试剂制备容易、稳定、有效期长,免疫酶技术得敏感性接近放射免疫试验,可直接肉眼观察也可借助简单得仪器作定量测定,所得结果比较客观。,酶免疫测定或免疫酶技术就是指酶标记抗体或酶标记抗体进行得抗原抗体反应。她主要包括两个方面:,免疫过氧化物酶法:以过氧化物酶作为标记,与抗原或抗体结合,然后根据酶与其底物间所产生得不溶性颜色产物,借助于光学或电子显微镜观察细胞及亚细胞水平得抗原或抗体。,酶联免疫吸附法:根据可溶性抗原或抗体与不溶性固相载体结合后,还保留其免疫活性,结合了作为标记得酶催化作用。,ELISA得基本原理和方法,ELISA得种类和变化,ELISA得特点,ELISA得应用实例,ELISA,4、2、1 基本原理,她采用抗原与抗体得特异反应将待测物与酶连接,然后通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定。测定得对象可以就是抗体也可以就是抗原。,在这种测定方法中有3种必要得试剂:,固相得抗原或抗体(,免疫吸附剂),酶标记得抗原或抗体(,标记物),酶作用得底物(,显色剂),测量时,抗原(抗体)先结合在固相载体上,但仍保留其免疫活性,然后加一种抗体(抗原)与酶结合成得偶联物(标记物),此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性,当偶联物与固相载体上得抗原(抗体)反应,结合后,再加上酶得相应底物,即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。,9,大家应该也有点累了，稍作休息,大家有疑问的，可以询问和交流,颜色反应得深浅与相应得抗体或抗原量成正比,因此可借助于颜色反应得深浅来定量抗体或抗原。,这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察,也可以用分光光度计(酶标仪)加以测定。,其方法简单,方便迅速,特异性强。,4、2、2 酶及其底物,酶结合物就是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结得产物。就是ELISA成败得关键试剂,她不仅具有抗体抗原特异得免疫反应,还具有酶促反应,显示出生物放大作用,但不同得酶选用不同得底物,将得到不同得颜色反应。,酶,底 物,显色反应,测定波长,辣根过氧化物酶,邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐,橘红色黄色棕色兰色蓝绿色,492,460,449425642,碱性磷酸酯酶,4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐,黄色红色,400500,葡萄糖氧化酶,ABTSHRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰,黄色深蓝色,405,420,-半乳糖苷酶,甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG),荧光黄色,360,450420,4、2、3 ELISA得种类和变化,(一)双抗体夹心法,(二)间接法,(三)竞争法,(四)双位点一步法,(五)捕获法测IgM抗体,(六)应用亲和素和生物素得ELISA,(一)双抗体夹心法,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,步骤:,A 将已知抗体吸附于载体上,温育后清洗;,B 加入待检标本溶液,使溶液中得抗原与吸附得抗体结合,温育后清洗;,C 加入酶标记特异性抗体,温育后清洗;,D 加入酶作用底物,产生显色反应,颜色得改变与所加得待检标本溶液中得抗原量成正比。,间接法就是检测抗体最常用得方法,其原理为利用酶标记得抗体以检测已与固相结合得受检抗体,故称为间接法。,(二)间接法,步骤:,A 将已知可溶性抗原吸附于载体(聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠),经温育后清洗;,B 加入待检稀释血清,若血清中有相应特异性抗体存在则与吸附得抗原结合,温育后清洗;,C 加入酶标记得抗球蛋白抗体,此时酶标记抗体与吸附得抗原抗体复合物结合,温育后清洗;,D 加入酶作用底物(或称基质),酶分解底物并显色,用光电比色计测定底物显色深浅,即可推知抗体量。,(三)竞争法,此法可用于检测小分子抗原。,步骤:,A 将已知抗体吸附于固相载体表面,温育后清洗;,B 将可能含抗原得待检溶液和酶标记得已知抗原溶液以适当比例混合,加入已包被得载体孔中,温育后清洗;,C 加入酶作用得底物,产生显色反应。色深表示结合得酶标记抗原多,而待检溶液中未标记得抗原量少;反之,色浅表示结合得酶标记抗原少,而待检溶液中抗原量多。,对照管由于只加酶标抗原,与固相抗体充分结合,故分解底物显色深;测定管得显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合得结果而异。如待测抗原量多,竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合,使固相上结合得酶标抗原量减少。因此,加入底物后显色反应较弱。,4、2、4 特点,特点一:灵敏性,该测定法得灵敏度来自酶。众所周知,酶就是一种有机催化剂,很少量得酶即可诱导大量得催化反应,产生可供观察得显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体得所在部位,或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。,例如,在测定血清中某一物质得含量时,化学比色法得敏感度为mg/ml水平,酶反应测定法得敏感度约为5,10g/ml。,特点二:特异性,其特异性来自抗体或抗原得选择性。抗原抗体得结合实质上只发生在抗原得抗原决定簇与抗体得抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系,所以抗原抗体反应具有高度得特异性。,例如乙肝病毒中得表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和核心抗体(HBcAg),虽来源于同一病毒,但仅与其相应得抗体结合,而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应得这种特异性使免疫测定能在一非常复杂得蛋白质化合物(例如血清)中测定某一特定得物质,而不需先分离待检物。,ELISA应用实例,饲料中盐酸克伦特罗得测定,饲料中毒素得测定(主要包括黄曲霉毒素,简曲霉毒素),饲料中有害微生物得快速筛检(如沙门氏菌),甲胺磷残留分析,甲基对硫磷残留分析,呋喃丹残留分析,ELISA在饲料安全检测中得应用,ELISA用于农药残留得检测,河豚毒素,植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素,苯并芘,主要有除草剂与杀虫剂两大类,例如杀暝松(FN)、,甲氟磷酸异已酶(SOMAN)、,草不绿(Alachor)、,西维因(Carbaryl)、,多菌灵及克菌丹(Captan)等。,农药得检测,:,ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒,ELISA在结缔组织病早期诊断中得应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2(hnRNPA2)/类风湿性关节炎(PtA)33抗体,ELISA在疾病诊断中得作用,ELISA法检测幽门螺杆菌抗体,ELISA试剂盒商业资讯,ELISA试剂盒,酶联免疫井,DNM-9602G酶标分析仪,DNM-9602 标配酶标分析仪,DNM-9602A酶标分析仪,几种酶标分析仪,