长链非编码SNHG1_miR-145_ADAM17轴在椎间盘髓核退变中的作用及其调控机制.pdf

197 CHINESE JOURNAL OF ANATOMY Vol.46 No.3 2023 解剖学杂志 2023 年第 46 卷第 3 期长链非编码SNHG1/miR-145/ADAM17轴在椎间盘髓核退变中 的作用及其调控机制*柴星宇 宋 将 朱静华 郝清海 袁崇明 刘 涛（徐州医科大学附属滕州市中心人民医院脊柱外科，滕州 277500）摘要 目的：研究长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因1（SNHG1）、miR-145及解整合素-金属蛋白酶 17（ADAM17）在椎间盘退变（IDD）组织中的表达，探讨SNHG1调控miR-145/ADAM17轴对椎间盘髓核细胞退变的影响及机制。方法：采用qRT-PCR、免疫印迹检测30例IDD患者经手术摘除的髓核组织SNHG1、miR-145与ADAM17的表达；双荧光素酶报告基因、RNA免疫共沉淀等确定SNHG1、miR-145与ADAM17的关系；白介素（IL）-1诱导髓核细胞建立细胞退化模型，SNHG1 siRNA或miR-145模拟物等转染后，CCK-8、流式细胞术等检测细胞增殖、凋亡以及相关分子指标的变化。结果：相比于对照髓核组织，IDD髓核组织中SNHG1与ADAM17表达上调，miR-145表达下调，均与Pfirrmann分级显著相关。SNHG1可通过海绵作用靶向miR-145，miR-145也可靶向ADAM17的3-非编码区（3-UTR）抑制ADAM17蛋白表达。SNHG1沉默逆转了IL-1诱导的髓核细胞凋亡及基质酶（基质金属蛋白酶13、ADAMTS4）合成，上调了collagen和aggrecan表达；而SNHG1过表达增强了IL-1诱导的上述效应。结论：SNHG1调控miR-145/ADAM17分子轴，促进髓核细胞凋亡和细胞外基质降解，参与椎间盘退变的发展变化。关键词 长链非编码RNA；小核仁RNA宿主基因1；miR-145；解整合素-金属蛋白酶17；椎间盘；退变Function and regulatory mechanism of long noncoding RNA SNHG1/miR-145/ADAM17 axis in nucleus pulposus degeneration of intervertebral disc*Chai Xingyu，Song Jiang，Zhu Jinghua，Hao Qinghai，Yuan Chongming，Liu Tao（Department of Spinal Surgery，Affiliated Tengzhou Central Peoples Hospital，Xuzhou Medical University，Tengzhou 277500，China）Abstract Objective：To explore the expressions of long noncoding RNA small nucleolar RNA host gene 1（SNHG1），miR-145 and a disintegrin and metalloproteinase 17（ADAM17）in intervertebral disc degeneration（IDD）tissues，and investigate the underlying mechanisms by which SNHG1 affects the degeneration of nucleus pulposus cells through regulating miR-145/ADAM17 axis.Methods：The expressions of SNHG1，miR-145 and ADAM17 in 30 IDD nucleus pulposus tissues were detected by qRT-PCR and Western blotting.The relationships between SNHG1，miR-145 and ADAM17 were determined by double luciferase reporter gene and RNA immunoprecipitation.Interleukin（IL）-1 induced nucleus pulposus cells to establish a degenerative cell model.Following transfection with SNHG1 siRNA or miR-145 mimics，CCK-8，and flow cytometry were used to detect the changes of proliferation，apoptosis and relevant molecular expressions.Results：Compared with the control nucleus pulposus，the expressions of SNHG1 and ADAM17 were up-regulated and miR-145 was down-regulated in IDD nucleus pulposus tissues，and they were all significantly correlated with Pfirrmann grade.SNHG1 targeted miR-145 through sponge action，and miR-145 also targeted the 3-noncoding region（3-UTR）of ADAM17 to inhibit the protein expression of ADAM17.Silencing of SNHG1 reversed IL-1-induced apoptosis of nucleus pulposus cells and the synthesis of matrix enzymes（matrix metalloproteinase 13 and ADAMTS4），and up-regulated the expression of collagenand aggrecan.However，SNHG1 overexpression enhanced IL-1-induced above effects.Conclusion：SNHG1 regulates miR-145/ADAM17 molecular axis，and promotes nucleus pulposus cell apoptosis and extracellular matrix degradation，thereby participating in the development of IDD.Key words long noncoding RNA；small nucleolar RNA host gene 1；miR-145；disintegrin and metalloproteinase 17；intervertebral disc；degeneration*徐州医科大学附属医院发展基金（XYFY202217）第 1 作者 E-mail： 通信作者，E-mail：收稿日期：2022-09-24；修回日期：2023-04-23doi：10.3969/j.issn.1001-1633.2023.03.003论 著 198 目 前 研 究 表 明，髓 核 微 环 境 白 介 素1（interleukin-1，IL-1）含 量 增 加、细 胞 外 基 质降 解、长 链 非 编 码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）及miRNA表达紊乱等因素可引起椎间 盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）1-3，具体分子机制尚不清楚。已知LncRNA小核仁RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1）可通过常见的海绵吸附、蛋白结合等机制调控基因表达4-5，并与miR-145/解整合素-金属 蛋白酶（disintegrin and metalloproteinase，ADAM）17存在潜在的相互作用6；然而，SNHG1/miR-145/ADAM17轴在椎间盘退变髓核细胞中的作用少有报道。本研究旨在探讨SNHG1/miR-145/ADAM17轴在椎间盘退变髓核组织中的表达，体外干预其病理进程，为椎间盘退变的生物学治疗提供新的方案。1 材料和方法1.1 实验材料椎间盘退变组30例人髓核组织，取自2019年1月至2021年1月在本院接受椎间盘突出手术的椎间盘退变患者（男性17例、女性13例，平均年龄44岁，年龄范围3651岁）。术前对所有患者进行常规磁共振成像，并采用Pfirrmann分类法分析椎间盘退变程度。另选15例脊柱骨折后接受椎间盘切除和融合手术的患者（男性8例、女性7例，平均年龄22岁，年龄范围1832岁）作为对照组。本研究经医院伦理委员会批准，并在术前获得每位参与者的书面知情同意。1.2 细胞培养、转染与模型构建用眼科剪将髓核组织剪成1 mm1 mm1 mm块，0.25%胰蛋白酶孵育30 min，然后以1 000 r/min 离心10 min。丢弃上清液，37下用型胶原酶消化组织4 h，5 000 r/min、4离心8 min，以DMEM/F12培养基悬浮和离心细胞，调整细胞密度为5105个/mL，接种到含胎牛血清、L-谷氨酰胺和1%链霉素和青霉素的DMEM/F12培养基中培养。培养基每3天更换1次，第2代用于实验。使用Lipofectamine 2000试剂盒将SNHG1 siRNA（si-SNHG1）及沉默对照siRNA、SNHG1质 粒（pcDNA3.1-SNHG1）及 对照载体质粒分别转染至指数生长期的髓核细胞中。以 不 同 浓 度（10、50、100、150 ng/mL）分 别 于 0、12、24、48 h检测各组细胞增殖情况，明确最适条件，以此构建髓核细胞退化模型。1.3 qRT-PCR使用TRIzol试剂盒从髓核细胞和组织中提取总RNA，分光光度计测定RNA的浓度和纯度；使用PrimeScript RT试 剂 盒 将1 g总RNA逆 转 录 成cDNA，然后应用SYBR Green qPCR SuperMix试剂盒，以SNHG1引物（上游引物序列为5-AGGCTGAAGTTA CAGGTC-3，下游引物序列为5-TTGGCTCCCAGTG TCTTA-3）、ADAM17引物（上游引物序列为5-GCA TTCTCAAGTCTCCACAAG-3，下游引物序列为5-C CTCATTCGGGGCACATTCTG-3）进行qRT-PCR，检 测SNHG1和ADAM17 mRNA的 表 达；使 用miScript RT试剂盒将总 RNA 中的 miRNA逆转录成cDNA，然后，以miR-145引物（上游引物序 列 为5-CGGCGTCCAGTTTTCCCAGG-3，下游引物序列为5-GTGCAGGGTCCGAGGT-3）应用miScript SYBR Green PCR Kit配合miScript PCR System进行PCR扩增，检测miR-145的表达。GAPDH和U6用作内参；GAPDH上游引物序列为5-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3，下 游 引物序列为5-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3；U6上 游 引 物 序 列 为5-CTCGCTTCGGCAGCAC A-3，下游引物序列为5-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3。根据系统生成的Ct值，通过2-Ct法计算相关基因的相对表达。所有反应重复3次。1.4 细胞增殖与凋亡检测使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖。将细胞接种在96孔板上，分别培养12、24 h和48 h。在不同的时间点，将CCK-8试剂加入孔中并培养2 h。在 微 孔 板 读 取 器 上 测 定490 nm处 的 吸 光 度 值（OD）。使用Annexin-V试剂盒检测细胞凋亡。用不含 EDTA 的胰酶消化细胞，并收集于离心管中，3 000 r/min、4离心5 min，悬浮于300 L结合缓冲液，添加5 L Annexin-V-FITC溶液，室温下暗箱孵育15 min，细胞核用5 L PI染色5 min，再添加200 L结合缓冲液，并评估细胞凋亡。1.5 免疫印迹检测使用裂解缓冲液从髓核细胞或组织中分离蛋白质，并通过BCA测定蛋白浓度。使用50 g样品进行SDS-PAGE，并转移到PVDF膜上。然后在室温下用5%牛血清白蛋白封闭膜1 h，随后与相应的一抗孵育，4过夜，抗体包括兔抗人ADAM17多克隆抗体（1100）、鼠抗人aggrecan单克隆抗体（1100）、兔抗人collagen多克隆抗体（12 000）、兔抗人基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-13多 克 隆 抗 体（13 000）、兔 抗 人ADAMTS4 多克隆抗体（11 000）和鼠抗人GAPDH单克隆抗 199 体（12 000），均购自Abcam公司。洗涤后，将膜与次级辣根过氧化物酶结合抗体（1500）孵育，特定蛋白质条带用ECL法观察。1.6 双荧光素酶报告试验采用Starbase V2.0预测与SNHG1潜在结合的miR-145及miR-145的潜在靶点ADAM17。扩增含野 生 型（wild type，WT）或 突 变 型（mutant type，MUT）3-非编码区（3-untranslated region，3-UTR）的SNHG1或ADAM17片段，并插入到荧光素酶报告基因载体pGL3中，构建荧光素酶报告质粒，记为SNHG1-WT/MUT或ADAM17-WT/MUT，报告质粒中的Renilla荧光素酶作为对照。将上述报 告 质 粒（每 孔0.05 g）分 别 与miR-145模 拟 物（50 nmol/L）或模拟物对照共转染HEK-293T细胞。使用双荧光素酶分析系统分析细胞的荧光素酶活性。1.7 RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation，RIP）使用EZ-magna RNA免疫沉淀试剂盒进行RIP分析。收集细胞并应用RIP裂解缓冲液进行裂解。将全细胞提取物与含有抗Ago2或对照IgG抗体磁珠的RIP缓冲液孵育。使用洗涤缓冲液洗涤珠子，添加蛋白酶K消化蛋白质。分离免疫沉淀RNA，并进行qRT-PCR分析。1.8 统计学处理采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。计量资料以xs表示，组间比较采用t检验、方差分析或线性回归分析等。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 退变髓核组织中SNHG1上调，与miR-145、ADAM17表 达及Pfirrmann分级相关30例椎间盘退变组髓核组织与对照组比较，SNHG1、ADAM17表 达 增 加，而miR-145表 达 降低（P0.001）（图1），且SNHG1表 达 与miR-145表达呈负相关（r=-0.96，P0.001）（图2A），与ADAM17表达呈正相关（r=0.98，P0.001）（图2B）；miR-145表达与ADAM17表达呈负相关（r=-0.96，P0.001）（图2C）。此外，SNHG1、ADAM17 表达与Pfirrmann分级均呈正相关（r=0.92、0.88，P0.001）；miR-145表达与Pfirrmann分级呈负相关（r=-0.93，P0.001）（图2D）。2.2 SNHG1、miR-145及ADAM17之间的碱基相互作用StarBase v2.0结果显示SNHG1可以结合miR-145，miR-145还可结合ADAM17（图3A）。RIP结果 显 示SNHG1和miR-145、miR-145和ADAM17之间存在碱基互补配对（P0.001）（图3B）。双荧光素酶报告分析证实，miR-145模拟物导致转染SNHG1-WT或ADAM17 3-UTR-WT报 告 子 的细胞荧光素酶活性受到抑制（P0.01）（图3C、图 1 椎间盘髓核组织 SNHG1、miR-145 及 ADAM17 蛋白的表达A：SNHG1；B：miR-145；C：ADAM17。*P0.0012.51.51.00.50.0SNHG1 相对表达量*对照组椎间盘退变组543210ADAM17 相对表达量*对照组椎间盘退变组86420miR-145 相对表达量对照组椎间盘退变组*ABC图 2 SNHG1、miR-145、ADAM17 表达的相关性分析A：SNHG1 与 miR-145 之间的相关性；B：SNHG1 与 ADAM17 之间的相关性；C：miR-145 与 ADAM17 之间的相关性；D：SNHG1、miR-145、ADAM17 与 Pfirrmann 分级的相关性分析43215432105432104.03.53.02.52.01.5miR-145 相对表达量ADAM17 相对表达量相对表达量ADAM17 相对表达量ABCD0.5 1.0 1.5 2.0SNHG1相对表达量0.5 1.0 1.5 2.0SNHG1相对表达量1234miR-145相对表达量Pfirrmann分级 200 3D），而 未 影 响 转 染SNHG1-MUT或ADAM17 3-UTR-MUT报 告 子 的 细 胞 荧 光 素 酶 活 性（P=0.64）（图3C、3D）。最后，miR-145模拟物抑制了 含ADAM17 3-UTR-WT的ADAM17蛋 白 表 达（P0.01）（图4），但 对 含ADAM173-UTR-MUT的ADAM17蛋白表达无影响（P=0.76）（图4）。2.3 IL-1诱导法成功构建体外人髓核细胞退化模型与PBS对照组比较，不同浓度的IL-1刺激后2.4 SNHG1沉默逆转IL-1诱导的髓核细胞退变si-SNHG1转 染72 h后，相 较 于 对 照 组，si-SNHG1直接抑制了SNHG1表达，抑制率达81.9%，并有效增加了miR-145表达，降低了ADAM17表达（P0.01）（图7A）。IL-1诱导48 h后，转染si-SNHG1的髓核细胞的增殖能力增加（P0.01）（图7B），凋亡受到抑制（P0.01）（图7C），aggrecan和collagen 表 达 水 平 增 加（P0.001）（图8A），图 3 SNHG1、miR-145 及 ADAM17 之间的相互作用A：StarBase v2.0 预测的潜在靶点序列示意图；B：SNHG1、miR-145、ADAM17 mRNA 在抗 IgG 和抗 Ago2 组中与输入量的比值，*P0.001 vs 抗 IgG 对照组；C：SNHG1 野生型或突变型共转染后的荧光结果，*P0.01 vs 模拟物对照组；D：ADAM17 野生型或突变型共转染后的荧光结果，*P0.01 vs 模拟物对照组图 5 IL-1 刺激后髓核细胞的增殖和凋亡A.CCK-8 检测细胞增殖结果，*P0.01 vs PBS 对照组；B.流式细胞术检测细胞凋亡结果；C：SNHG1、miR-145、ADAM17 的表达，*P0.01 vs PBS 组的髓核细胞增殖受到明显抑制，呈时间和浓度依赖 性（P0.01）（图5A）；其 中，以150 ng/mL的IL-1刺激48 h的抑制效果最佳。与PBS对照组比较，IL-1增加了髓核细胞的凋亡率（P0.01）（图5B），增 加 了SNHG1和ADAM17蛋 白 的 表达（P0.01）（图5C），并降低了miR-145的表达（P0.01）（图5C）。在IL-1诱导的髓核细胞中，aggrecan和collagen 下 调（P0.001）（图6A），而MMP13和ADAMTS4上调（P0.001）（图6B）。MMP13和ADAMTS4表达水平降低（P0.001）（图8B）。2.5 SNHG1过表达加重IL-1诱导的髓核细胞退变pcDNA3.1-SNHG1转 染 髓 核 细 胞72 h后，SNHG1的表达增加3倍（图9A），质粒转染的效率为76.8%。相较于对照组，SNHG1质粒导致miR-145表达下调，ADAM17表达上调（P0.01）（图9A）。IL-1诱导后，转染pcDNA3.1-SNHG1髓核模拟物对照组miR-145模拟物组模拟物对照组miR-145模拟物组SNHG1miR-145ADAM17相对荧光强度相对荧光强度输入量的百分数SNHG1 野生型SNHG1 突变型ADAM17 野生型抗 lgG 对照组抗 Ago2 组ADAM17 突变型0 ng/mL10 ng/mL50 ng/mL100 ng/mL150 ng/mL相对表达量PBS 组PBS 组IL-1 刺激组IL-1 刺激组OD 值SNHG1miR-145ADAM17BDCACBA2.01.51.00.50.0*图 4 含野生型（A）或突变型（B）3-UTR 的 ADAM17 全长基因与 miR-145 模拟物共转染 HEK-293T 后 ADAM17 蛋白的表达1：模拟物对照组；2：miR-145 模拟物组；*P0.01 vs 模拟物对照组相对表达量相对表达量1.51.00.50.01.51.00.50.0*12121212ADAM17GAPDHADAM17 3-UTR 野生型ADAM17 3-UTR 突变型0 h 12 h 24 h 48 hAB 201 图 6 IL-1 刺激后髓核细胞细胞外基质标志物表达的变化A：免疫印迹检测 aggrecan 和 collagen 表达结果；B：免疫印迹检测 MMP-13 和 ADAMTS4 表达结果。*P0.001 vs PBS 组图 8 SNHG1 沉默后的髓核细胞细胞外基质标志物表达的变化A：免疫印迹检测 aggrecan 和 collagen 的表达结果；B：免疫印迹检测 MMP-13 和 ADAMTS4 的表达结果。*P0.001 vs 沉默对照组图 7 SNHG1 沉默对髓核细胞 SNHG1、miR-145、ADAM17 表达的影响A：SNHG1 沉默后 SNHG1、miR-145 及 ADAM17 的表达变化；B：CCK-8 检测的细胞增殖结果；C：流式细胞术检测的细胞凋亡结果。*P0.01 vs 沉默对照组图 9 SNHG1 过表达对髓核细胞 SNHG1、miR-145、ADAM17 表达的影响A：SNHG1 过表达后 SNHG1、miR-145 及 ADAM17 的表达变化，*P0.01 vs 载体对照组；B：CCK-8 检测的细胞增殖结果；C：流式细胞术检测的细胞凋亡结果。*P0.01 vs 载体对照组相对表达量相对表达量相对表达量相对表达量相对表达量SNHG1miR-145ADAM17AggrecanCollagen GAPDHAggrecanCollagen GAPDHMMP-13ADAMTS-4GAPDHAggrecanCollagen AggrecanCollagen MMP-13ADAMTS-4MMP-13ADAMTS-4沉默对照组SNHG1沉默组相对表达量沉默对照组PI 沉默对照组载体对照组SNHG1沉默组PI SNHG1沉默组SNHG1质粒组PBS 组沉默对照组沉默对照组沉默对照组沉默对照组PBS 组IL-1组SNHG1 沉默组SNHG1 沉默组SNHG1 沉默组SNHG1 沉默组IL-1组PBS 组IL-1组PBS 组IL-1组BCBBCAAAASNHG1miR-145ADAM17OD 值OD 值MMP-13ADAMTS-4GAPDH载体对照组SNHG1质粒组载体对照组PISNHG1质粒组PI 细胞的增殖明显抑制（P0.01）（图9B），凋亡明显增加（P0.01）（图9C），aggrecan和collagen 水平降低（P0.001）（图10A），MMP13和ADAMTS4水平增加（P0.001）（图10B）。104103102101100104103102101100100 101 102 103 104AnnexinV FITC100 101 102 103 104AnnexinV FITC104103102101100100 101 102 103 104AnnexinV FITC100 101 102 103 104AnnexinV FITC104103102101100B 202 3 讨论LncRNA已被广泛证实参与一系列细胞活动，包括细胞周期、生长、分化、凋亡和退化。但一些LncRNA在IDD中被发现表达紊乱，如Yu 等7研究表明，LncRNA HOTAIR通过调节miR-34a/Bcl-2轴抑制肿瘤坏死因子诱导的髓核细胞凋亡；Zhu等8 报 道LncRNA LINC00284通 过 调 节miR-205-3p/Wnt/-catenin轴促进髓核细胞增殖和细胞外基质（extracellular cell matrix，ECM）合 成；Xi等9证 实LncRNA HCG18通 过miR-146a-5p/TRAF6/NF-B轴抑制髓核细胞的生长，并促进椎间盘退变的发展。已有证据显示，SNHG1通过调节miR-145及其靶点参与肿瘤的发生5，miR-145通过ADAM17参与了椎间盘髓核细胞退变10。基于碱基互补配对原则，SNHG1/miR-145/ADAM17轴可能存在于椎间盘退变中，并发挥一定作用。本研究首先证实了SNHG1在椎间盘退变髓核组织中表达上 调，与miR-145、ADAM17、Pfirrmann分 级 密切相关；荧光素酶报告实验和RIP实验直接证实了这一轴路的碱基作用机制，提示SNHG1/miR-145/ADAM17轴的确存在于椎间盘退变中，可能参与椎间盘退变的发生和发展。早期研究表明，髓核中ECM主要成分胶原和aggrecan的合成代谢减少或分解代谢增加是IDD发生的重要原因，可导致髓核结构完整性和功能受 损11。基质降解酶在ECM的降解中起着至关重要的作用12，主要包括MMP和ADAMTS家族。IL-1被认为是椎间盘退变中上调的主要炎症因子，导致髓核细胞凋亡增加，MMP和ADAMT表达增强，collagen和aggrecan的合成减少13-15。因此，抑制IL-1对ECM代谢的影响可能促进ECM沉积，延缓椎间盘退变的进展。本研究结果显示，SNHG1沉默可逆转IL-1诱导的髓核细胞凋亡和ECM降解，提升ECM合成能力；然而SNHG1过表达加剧了以上IL-1效应，提示SNHG1途径是椎间盘退变发生发展中不可缺少的一环，可以作为椎间盘退变治疗的靶点。基于LncRNA海绵吸附理论16 和SNHG1/miR-145/ADAM17轴在椎间盘退变中作用的确立，笔者认为，退变髓核细胞中的SNHG1吸 附miR-145，减少了miR-145对ADAM17 3-UTR的 结合，促进了ADAM17 mRNA的转录，直接或间接地调节了髓核细胞凋亡和ECM相关基因表达。然而该理论仍需更多体外和体内实验予以验证。本研究尚存在一定局限性。首先，组织检测的结果可能受样本数量、来源、单一性、异质性等因素影响。其次，尽管SNHG1下调对髓核细胞表型的作用已被证实，但SNHG1下调的机制尚不完全清楚。另外，人为减少SNHG1后对髓核细胞的其他潜在影响尚不清楚，miR-145是否通过更多靶点途径抑制椎间盘退变的发生发展仍需探讨。综上所述，SNHG1调控miR-145/ADAM17分子轴，促进髓核细胞凋亡和ECM降解，参与了椎间盘退变的发展变化。SNHG1/miR-145/ADAM17信号轴将有可能为椎间盘退变的分子靶向治疗提供重要理论支撑。参 考 文 献1 Wang Y，Che M，Xin J，et al.The role of IL-1 and TNF-in intervertebral disc degenerationJ.Biomed Pharmacother，2020，131（11）：110660.2 Guo H Y，Guo M K，Wan Z Y，et al.Emerging evidence on noncoding-RNA regulatory machinery in intervertebral disc degeneration：A narrative 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