棉兰染色-张健东.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,真菌真菌镜检染色,-,乳酸棉兰酚染色,天津市第三中心医院,检验科 张健东,真菌标本的接种,培养基选择,常用,染色方法,曲霉菌属镜下形态和菌落特点,病例分析,医学重要的霉菌分类,合格痰标本,分类,细胞数,/,低倍视野,WBC,扁平上皮细胞,5,25,25,10-25,含,1-2,种不同细菌，可考虑继续培养，结果可根据病情再作分析,超过,3,种细菌，按不合格标本处理。,中华检验医学杂志,2000,23(5):312,真菌标本的接种,呼吸道,标本,肺泡灌洗液,无菌体液：,（脑脊液、,穿刺液、骨髓、玻璃体等）,无菌体液,1-5ml,打入,真菌,/,分枝杆菌血培养瓶,三区划线,28,孵箱，,5,天,培养基用封口膜密封好,怀疑生长缓慢菌（如组织胞浆菌），延长培养时间至,30,天。,怀疑真菌,生长,，点种,真菌培养,宜使用含和不含抗菌药物的两类培养基。经空气传播有高度感染性的真菌样品、含菌丝体的真菌应在生物安全柜内处理。若采用平皿培养，应封盖。,CNAS-CL42,：,2012,培养基选择,沙保罗培养基,SDA,马铃薯培养基,PDA,CHROMagar念珠菌显色培养基,菌落形态,（,菌落大小、形态、色素、颜色和质地,）,显微镜下真菌孢子、菌丝、产孢等特征性结构进行初步判断真菌种属,。,遇到疑难的丝状真菌，应请专业组内多名技术人员观看、讨论，以确定种属。,每次观察的菌落特征均需要记录、并照下显微镜下的形态特征和菌落。,参考图谱或网上咨询,真菌培养物形态学鉴定,菌落形态,观察,酵母型菌落,类酵母型菌落,丝状型菌落,（正、反）,双相真菌,显微镜检查,有隔或无隔,分支或不分支,有色或无色,形态学鉴定,常见显微镜检查方法,KOH,压片法（直接镜检）,墨汁染色,乳酸酚棉兰染色,六胺银染色,革兰染色,：回顾性看有利于,诊断,显微镜检查方法,KOH,压片：皮屑、毛发、指甲、脓液、痰等标本置于载玻片上，加一滴10-20%KOH，盖上盖玻片镜检，加热30-60s，镜检先低倍后高倍,（,在,KOH,中加入刚果红1:1更有利于真菌检测）,墨汁染色：以无菌吸管吸取处,过的标本一滴置于玻片上，,再加上一小滴印,墨汁混合均匀，以40角盖上盖玻片,(避免产生气泡)镜检,（样本与墨汁等量混合）,显微镜检查方法,显微镜检查方法,乳酸酚棉兰染色：,通常采用透明胶带法,利用胶带先粘一定量菌丝,再粘在预先滴加乳酸酚棉兰的载玻片上,显微镜下观察孢子和菌丝的形态、特征、大小和排列等。,六胺银染色,涂片（痰需消化，无菌液体离心）甲醇固定后自然风干,过碘酸滴染,10,分钟，溶液用后弃去,流水冲洗（,3,遍）,65,银溶染液,1h-1.5h,染色时间根据涂片的厚度所怀疑真菌的种类，通常念珠菌染色,1h,即可，疑为曲霉或者其他丝状真菌须适当延长染色时间（银溶液需现用现配，只用一次）,流水冲洗（,3,遍）,0.25%,的氯化金染,1,到,2,分钟（可重复使用）,流水冲洗,3%,的硫代硫酸钠染,1,分钟,流水冲洗,0.1%,的亮绿染色,30,秒到,1,分钟,目的使得到一个背景色,显微镜检查方法,菌体的包囊壁呈黑色,曲霉菌镜下形态特点,菌丝体形态,曲霉菌丝有隔膜，为多细胞霉菌。,分枝（45,角）,有分枝足细胞,分生孢子梗顶端膨大成为顶囊，一般呈球形。,烟曲霉菌落特点,培养特性：,生长快,45,仍可生长,开始为白色,2-3,日后转为蓝绿色,背面无色或黄褐色,表面粉末状,烟曲霉菌落,PDA,25,7d,镜下形态,分生孢子头短粗型，梗光滑，,4/5,小梗覆盖，倒立烧瓶状顶囊，顶囊有单层小梗,小分生孢子呈球形，绿色，有小刺,镜下形态,足细胞,顶囊,18,鉴别要点,45,生长良好，菌落呈蓝绿色,顶囊呈烧瓶状，小梗为单层，与双层的土曲霉，杂色曲霉，构巢曲霉相区别,顶囊单层和双层两种,瓶梗的,黄曲霉和黑曲霉鉴别，蓝绿色可与绿曲霉和棒曲霉鉴别,形态学观察,黄曲霉菌落特征,生长快,孢子黄色,表面粉末状,黑曲霉菌落特征,生长快,PDA,培养基菌落初为白色继而黑色,背面无色或中央略褐色,厚绒状,气生菌丝多,镜下形态,分生孢子头疏松放射状，梗无色，小梗为单层，双层，或单双层同时生于一个顶囊，成放射状,小分生孢子呈球形或梨形，表面粗糙,镜下形态,分生孢子*,400,分生孢子*,1000,鉴别要点,顶囊有单层和双层瓶梗，可与烟曲霉，土曲霉以及杂色曲霉和构巢曲霉相鉴别。,分生孢子梗光滑，无色至褐色，菌落初为白继而黑色，可与黄曲霉鉴别。,形态学观察,土曲霉菌落特征,生长快,菌落圆形,孢子淡棕色或棕色,形态学观察,构,巢,曲霉,绿色，浅黄到黄色（正面）,紫红色到橄榄色（背面）,顶囊,（,半球形或烧瓶状,）,小梗,双层，第一层略长,孢子,(,球形，粗糙，成链排列,),形态学观察,杂色曲霉菌落特征,菌落生长慢,紧密、圆形,绒毛状到羊毛状,颜色数种，从青绿到红绿,曲霉,菌,形态特点,曲霉菌,菌落颜色,分生孢子头,分生孢子梗,瓶梗,正面,反面,烟曲霉,灰绿、蓝绿,浅黄,柱状,滑壁,，,无色或绿色,单,层,黄曲霉,黄,-,绿,黄,褐,放射状,，,成熟变柱状,粗糙、无色,单,层,、双,层,黑曲霉,黑,白,浅黄,放射状，,成熟变疏松,滑壁,，,无色或棕色,单,层,、双,层,土曲霉,棕,肉桂,浅黄、棕色,柱状,滑壁,无色,双,层,构巢曲霉,绿、浅黄,浅紫,、,红,橄榄色,短柱状,滑壁，棕色,双,层,杂色曲霉,白、浅黄、黄、,粉黄、灰白、绿,白,黄,浅紫、红,放射状,滑壁,无色,双,层,青霉属,培养特性,橘青霉,PDA,培养基上,25-28,生长较快，菌落表面呈绒状，少数为絮状，表面为蓝色或灰绿色，背面黄色至橙色。,绳状青霉表面白色至粉色，有时有蓝绿色 区域。,马尔尼菲青霉初为灰白色蜡样，膜状平坦 菌落，逐渐变成淡黄，黄绿色，背面红色,2,周左右表面呈淡红色绒毛状，整个培养基被染成玫瑰红色,菌落特点,镜下形态,分生孢子梗大多从基质长出，或气生菌丝生长，每个梗基上簇生,6-10,个平行而略密的小梗，形成特征性的帚状枝。,临床意义,橘青霉可引起肾脏的损害，有弱致癌性；,绳状青霉可引起大米变质并引起中毒；,马尔尼菲青霉引起皮肤结节，皮下脓肿及网状内皮系统感染，预后凶险。,链格孢属,培养特性,SDA,培养基上,28,培养，生长迅速，形成棉絮状，后变为绿褐色至深褐色，背面为黑色。,镜下形态,分生孢子梗直立，暗色，分隔，单生或分枝状。分生孢子砖格状，倒棍棒状，有尖，光滑或粗糙，水平，垂直，或斜形分隔。,临床意义,链格孢可引起皮下组织脓肿和溃疡，还可引起足菌肿。,病例分析,现病史,女，,78,岁，天津东丽区人，患者因反复咳嗽咳痰、憋喘十余年加重,5,天、神志不清,1,天入院。入院,5,天前出现咳嗽咳痰加重，痰液呈黄粘状不易咳出，于当地卫生院就诊，给予平喘消炎治疗（消炎药未知）未见好转，喘息加重。,1,天前神志不清，我院急诊查血气，显示,II,型呼衰，进行器官插管，收入,ICU,。,病例分析,既往史,长期吸烟史、糖尿病史、高血压史，长期使用,“,野药,”,（可疑激素）史。,病例分析,入院检查,体温,37.2,，昏迷、对光反射消失，双肺呼吸音粗，可闻及干湿性罗音，心率,24 BPM,，血压无法测出；,白细胞,12.42*10,9,/L,，,PCT 7.66 ng/ml,，微生物动态真菌监测,41.45 ng/ml,。肺炎支原体培养阳性，痰培养为多重耐药鲍曼不动杆菌,肺,CT,提示：双肺下叶炎性病变，考虑右肺中叶膨胀不全，双肺间质性改变，双肺肺气肿，双肺索条状及钙化点。,病例分析,病例分析,治疗及转归,给予阿奇霉素和舒普深治疗，同时使用甲强龙扩张气道平喘，不排除肺真菌感染的可能性，继续行痰培养和真菌培养检查,3,月,27,日真菌培养结果为烟曲霉，加伏立康唑治疗。,3,月,30,日，患者气道痉挛较前好转，喘憋减轻。,3,月,31,日，,PCT 1.03ng/ml,，患者气道痉挛明显好转，喘憋减轻，适当下调呼吸机条件，双肺呼吸音低，可闻少量湿罗音。,病例分析,培养基,镜下形态,病例分析,治疗及转归,4,月,12,日，脱机；,4,月,17,日，两次痰真菌培养阴性，微生物动态真菌监测阴性，伏立康唑用足疗程，决定停药；,4,月,22,日，脱机,9,日，患者,COPD,，但不能脱离无创机械通气辅助，提示预后不良，家属拒绝再次插管；,4,月,25,日，患者自动出院。,病例分析,WBC,NEU,HGB,PCT,G,试验,3.23,12.42,84.4%,99,7.66,41.45,3.26,11.14,93.7%,106,8.33,125.30,4.7,9.81,85.9%,91,0.53,103.40,4.12,10.16,85.8%,76,1.29,10,病例分析,分析,患者入院痰培养提示多重耐药鲍曼不动杆菌，给予舒普深治疗；,后真菌培养提示烟曲霉感染，给予伏立康唑治疗后，病人病情明显好转；,继续行痰培养和真菌培养检测，痰培养依旧提示鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌；,考虑应用舒普深导致肠道菌群失调逆行入患者气道内所产生的感染，并非患者侵袭性肺病的根本病原菌。,病例分析二,现病史,女，,65,岁，河北省定州市人，入院前一周感咳嗽，为黄色黏痰，伴憋气，伴双下肢水肿，伴皮肤黏膜黄染加重，伴尿色加深，于,2015,年,5,月,13日收入我院肝内病区。,既往史,患者自身免疫性肝硬化病史，曾行食道静脉曲张套扎治疗，低蛋白血症，胆红素明显增高，肝功能储备差，应用激素治疗。,入院检查,肝病面容，皮肤巩膜重度黄染，体温,36.0,，白细胞,9.16*,10,9,/L,，中性粒细胞百分比,92.0%,，,HB 105g/L,，,PCT 0.35ng/ml,。,病例分析,治疗与转归,5,月,14,日，体温,37,，咳嗽咳痰，行痰培养检查；,5,月,15,日，胸片提示：双下肺纹理增粗；患者长期服用激素，免疫力低下，易合并感染，考虑肺炎，给予拜福乐抗感染治疗；,5,月,20,日，患者体温,38.2,，咳嗽、咳痰、痰中带血，,CT,提示双肺多发结节影及团片状致密影。,病例分析,5,月,21,日，送检痰培养；,5,月,22,日，痰培养回报怀疑曲霉菌感染，遂请呼吸科会诊，不排除曲霉菌感染，送检痰真菌培养，并加用伏立康唑。,5,月,25,日，葡聚糖,105.70 pg/ml,，白细胞,5.18*10,9,/L,，痰真菌培养提示烟曲霉。,病例分析,病例分析,病例分析,莫西沙星抗,感染,胸,CT,提示,双肺多发结节影,及团片状致密影,痰培养疑似曲霉菌感染,呼吸科会诊,伏立康唑,真菌培养,提示,烟曲霉感染,胸,CT,提示,炎症吸收消散,偶有咳嗽,胸,CT,提示,炎性病变,治疗后改变,病例分析,5,月,27,日，患者咳嗽咳痰较前好转，无痰中带血，体温正常。,5,月,28,日，复查胸,CT,，双肺多发结节影及团片状致密影，较前吸收消散、数量减少。,6,月,2,日，患者偶有咳嗽，咳痰较前明显减少；,6,月,4,日，胸,CT,提示双肺多发空洞样病变，考虑炎性病变治疗后改变，患者出院。,谢谢聆听!,