生物学利用MEGA5.0及Clustalx软件构建进化树.doc

生物学利用MEGA5.0和Clustalx1.83软件构建进化树
MEGA是一个关于序列分析以及比较统计的工具包，从3.1版本到后来的4.0版本一直都广为大家熟悉，现在推出了Mega5.0版本。功能比以前多有改进。现主要介绍使用Mega 5.0构建系统进化树的方法。供大家参考。
用MEGA构建进化树有以下步骤：
1、测序：
将克隆扩增测序得到的16S rDNA序列进行测序。
2、NCBI上做Blast
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi
找到相似度最高的几个序列，确定一下你分离的细菌大约属于哪个科哪个属，如果相似度达到百分之百那基本可以确定你分离得到的就是Blast到的那个，然后寻找相似性最高的细菌，通常把该属的序列（Fasta格式文件）下载下来，或点击GenBank登录号，复制FSATA格式，整合在一个*.txt文档中（单独建立一个文件夹存放，后面的很多文件会自动装入该文件夹），如
>XXXX
AGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAGCGAGGGTGCTTGCACCTTAGCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGG

>gi|289469964|gb|GU388381.1| Acinetobacter tandoii strain DSM 14970 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
ACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGGATGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGA……
…………………….
参考序列选择注意事项：
1、不选非培养(unclutured)微生物为参比；
2、不选未定分类地位的微生物，最相近的仅作参考；c，在保证同属的前提下，优先选择16S rDNA全长测序或全基因组测序的种；d，每个种属选择一个参考序列，如果自己的序列中同一属的较多，可适当选择两个参考序列。
3、 使用clustalx1.83进行序列比对
打开压缩文件clustalx1.83，运行其中的clustalx.exe文件，如图：

点击File/load sequences，将整理好的*.txt序列文件导入clustalx1.83，如图

接着点击Alignment/Do Complete Aligment

程序自动运行，得出结果，自动输出*.aln 和* .dnd 为后缀的两个文件，并自动存入你*.txt文件所在的文件夹内。

序列比对也可以直接用MEGA来做。
4、运行程序MEGA 5.0，如下图所示：

点击：File导入Clustal程序得到的*.aln文件。再点File/Convert to MEGA Format，打开转换文件对话框，从目的文件夹中选中Clustal 对比分析后所产生的*.aln文件，转换为*.meg文件。转换时一路确认相关界面。最后查看meg序列文件最后是否正常，命名新文件存盘保存*.meg文件，*.meg文件会和aln文件保存在上述*.txt同一个文件夹中。

5、 关闭转换窗口，回到主窗口，现在点面板上的“Click me to activate a data file”打开刚才的*.meg文件。

如果为核酸序列，选择“Nucleotide sequence”，点击“OK”，得到以下图示。

选择默认的Standard，点击OK后，如图所示。

点击程序中的，可以得到下图

在另外一个窗口内，出现以下数据文件点击选择和编辑数据分类图标， 可对所选择的序列进行编辑，完成后点击close即可。

序列编辑完成后，可进行保存，点击保存后出现以下界面，点击ok即可。

构建进化树的算法两类主要方法简要说明：
独立元素法（discrete character methods）是指进化树的拓扑形状是由序列上的每个碱基/氨基酸的状态决定的（例如：一个序列上可能包含很多的酶切位点，而每个酶切位点的存在与否是由几个碱基的状态决定的，也就是说一个序列碱基的状态决定着它的酶切位点状态，当多个序列进行进化树分析时，进化树的拓扑形状也就由这些碱基的状态决定了）。
距离依靠法（distance methods）是指进化树的拓扑形状由两两序列的进化距离决定的。进化树枝条的长度代表着进化距离。独立元素法包括最大简约性法（Maximum Parsimony methods）和最大可能性法（Maximum Likelihood methods）；距离依靠法包括除权配对法（UPGMAM）和邻位相连法（Neighbor-joining）。
（1） phylogeny→UPGMA

（2）用Bootstrap构建进化树，MEGA的主要功能就是做Bootstrap验证的进化树分析，Bootstrap验证是对进化树进行统计验证的一种方法，可以作为进化树可靠性的一个度量。各种算法虽然不同，但是操作方法基本一致。进化树的构建是一个统计学问题。我们所构建出来的进化树只是对真实的进化关系的评估或者模拟。如果我们采用了一个适当的方法，那么所构建的进化树就会接近真实的“进化树”。模拟的进化树需要一种数学方法来对其进行评估。不同的算法有不同的适用目标。一般来说，最大简约性法适用于符合以下条件的多序列：i 所要比较的序列的碱基差别小，ii 对于序列上的每一个碱基有近似相等的变异率，iii 没有过多的颠换/转换的倾向，iv 所检验的序列的碱基数目较多（大于几千个碱基）；用最大可能性法分析序列则不需以上的诸多条件，但是此种方法计算极其耗时。如果分析的序列较多，有可能要花上几天的时间才能计算完毕。
具体构建过程如下
① 参数的设置：点击，选择该菜单中的Construct/test Neighbor-Joining tree，选择前面转换得到的*meg文件，得到下图
点击OK
对下图的参数进行设置：
说明：
系统进化树的测试方法Test of Phylogeny，通常要选择Bootstrap method，也可以选择不进行测试；
重复次数No. of bootstrap Replications——通常设定至少要大于100比较好，随机数种子可以自己随意设定，不会影响计算结果。一般选择500或1000。
Model/Method——通常选择Kimura 2-parameter。

设定完成，点compute，开始计算得到进化树构建的结果。如下图所示；

该窗口中有两个属性页，一个是原始树Original tree，一个是bootstrap验证过的一致树Bootstrap concensus tree。树枝上的数字表示bootstrap验证中该树枝可信度的百分比。
得到构建的进化树后可以对该进化树进行优化。
(本文参考网友的文章，同Mega的其它版本使用基本相同，在此表示感谢。以下进化树的优化部分直接引用)
(1)利用该软件可得到不同树型，如下图所示：

除此之外，还可以有多种树型，根据需要来选择。

２）显示建树的相关信息：点击图标i。

３）点击优化图标，可进行各项优化：
􀀹 Tree栏中，可以进行树型选择：rectangular tree/circle tree/radiation tree。每种树都可以进行长度，宽度或角度等的设定

􀀹 Branch：可对树枝上的信息进行修改。

􀀹 Lable：可对树枝的名字进行修改。

􀀹 Scale：标尺设置

􀀹 Cutoff：cut off for consensus tree。一般为50%。

9、进化树的分类优化
􀀹 Place root on branch：可以来回转换。

􀀹 Flip subtree：180度翻转分枝，名字翻转180度。
􀀹 Swab subtree：交换分枝，名字不翻转。
􀀹 Compress/expand subtree与Set divergent time：可以把同一分枝的基因压缩或扩展。
点击Compress/expand subtree后，在要压缩的分枝处点击，出现以下界面，在name/caption 中输入文件名（例如wwww），其他还有很多的选项，设置好了，点击OK。

所得到的结果，可以在压缩和扩展之间转换。

10. 调整进化树
根据所的进化树的效果，要进行调整，包括多余序列删除、不足序列添加、种属名称标注等等，还要根据投稿杂志要求在PHOTOSHOP中修改等。完成后的进化树应包含充足的信息。参考网友的进化树完成图如下：

（再次对贡献《如何使用Mega3.1构建进化树》原文的网友表示致谢，本文是在学习该文的基础上，分享给大家的，仅供参考）