正交试验优选白柳皮的提取工艺.pdf

香料香精化妆品FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS2023年8月第4期Aug.2023,No.4分析与测评133www.ffc-*基金项目：杨凌示范区产学研用协同创新重大项目（编号2018CXY-03）收稿日期：2022-08-11；修回日期：2022-10-09作 者1.陕西嘉禾药业有限公司，陕西西安 710086；2.陕西嘉禾生物科技股份有限公司，陕西西安 710086 杨世帅1 童 红2#正交试验优选白柳皮的提取工艺*摘 要以水杨苷含量及白柳皮提取物收率为评价指标，采用 L9(34)正交试验设计，考察乙醇体积分数、料液质量体积比、提取时间、提取次数对白柳皮提取工艺的影响，筛选最佳提取工艺。利用 HPLC 法测定提取物中水杨苷的含量，以水杨苷含量及白柳皮提取物收率确定其最佳提取工艺为：4 倍量的 80%乙醇（体积分数）热回流提取 2 次，每次 2 h。采用该工艺,白柳皮提取物中水杨苷含量为 16.5%（质量分数），高于市售产品。综上，优化后的提取工艺稳定可靠，适合工业化生产，可为白柳皮资源开发利用提供参考。关键词白柳皮 提取工艺 正交试验 水杨苷Optimization of Extraction Process of White Willow Bark by Orthogonal Experiment*YANG Shishuai1 TONG Hong2#(1.Shaanxi Jiahe pharmaceutical Co.,Ltd.,Xian 710086,Shaanxi,China;2.Shaanxi Jiahe Phytochem Co.,Ltd.,Xian 710086,Shaanxi,China)Abstract:The content of the salicin and the white willow bark extract yield were chosen as the evaluation indicators,and the L9(34)orthogonal test was used to investigate the effects of ethanol volume fraction,ratio of solid-liquid,extraction time,extraction times on the extraction process of white willow bark,and then choose the optimum extraction process.HPLC method was used to determine the content of salicin in the extract.Based on the content of the salicin and the white willow bark extract yield,the optimum extraction process was determined as follows:the solid-liquid ratio at 1:4,ethanol vloume concentration is 80%and reflux extract twice,each for 2 h.Using this process,the mass content of the salicin in white willow bark extraction was 16.5%,higher than that of commercially available products.In summary,the optimum extraction process is stable,feasible,and suitable for industrial production.It can provide reference for the development and utilization of white willow bark resources.Keywords:white willow bark extraction process orthogonal experiment salicin白柳皮是杨柳科柳属植物白柳（Salix alba L.）的干燥枝皮或茎皮。白柳皮中含活性成分水杨苷 1，水杨苷具有抗炎、解热、镇痛、抗风湿等作用 2-6。在美国、欧盟等地区，白柳皮提取物已被广泛应用于膳食补充剂、药用原料以及化妆品中 7-9。蒲凌云等 10探讨了大孔树脂纯化水杨苷的静态吸附和解吸性能；房春林等 11采用大孔树脂分析与测评杨世帅，等作 者 简 介杨世帅（1984），男，本科学历，主管药师，主要从事质量管理及天然产物研究与开发工作。#通信作者：童红（1987），女，研究生学历，工程师，主要从事质量管理及天然产物研究与开发工作。联系电话：[phone]E-mail:DOI:10.20099/j.issn.1000-4475.2022.0191分析与测评2023 年 8 月香料香精化妆品134www.ffc-分离、正丁醇萃取、重结晶方法从白柳皮中提取水杨苷；研究多为白柳皮提取物水杨苷纯化和富集，工艺操作复杂，载体均使用到树脂材料，树脂的再生处理及废弃易造成环境污染，导致相应的环保支出增加 12。闫雪 13比较了水提法、有机溶剂法、超声波法对白柳皮水杨苷得率的影响，乙醇提取和水提取水杨苷的得率较高。考虑工业化生产及乙醇提取液不易霉变的特点，采用乙醇热回流提取白柳皮，通过正交试验优选工艺条件，旨在筛选出可行的白柳皮提取工艺，为开发白柳皮提供工艺支持。1 材料与仪器1.1 材料与试剂白柳皮，购自咸阳大自然药材有限公司（批号 20190801），经陕西嘉禾药业有限公司中药材管理员高娟鉴定为杨柳科柳属植物白柳 Salix alba L.的枝皮。白柳皮经晒干，粉碎成 20 目（0.85 mm）粗粉后供试验用。水杨苷对照品（批号 SLBJ1218V，纯度为 99.1%），Sigma；乙腈（纯度为 99.9%）、乙醇（纯度为 99.7%）等，北京迈锐达科技有限公司。1.2 仪器2695-2998 型高效液相色谱仪，美国 Waters 公司；KQ-250E 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；101-3AB 型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司。2 方法与结果2.1 水杨苷的测定2.1.1 对照品溶液的制备取水杨苷对照品约 20 mg，精密称定，置于50 mL 容量瓶中，加水超声溶解并定容至刻度，摇匀。2.1.2 供试品溶液的制备将白柳皮药材粉碎，过筛，得粗粉。取粗粉约20.0 g，精密称定，置于500 mL圆底烧瓶，加1.0 g生石灰及 200 mL 的 70%（体积分数）甲醇回流提取 3 次，每次 1 h，合并提取液，减压浓缩并干燥。精密称定 60 mg 干膏粉，置于 50 mL 容量瓶中，加水超声溶解并定容至刻度，摇匀后取上清液，经微孔滤膜过滤，即得。2.1.3 色谱条件色谱柱：Agilent TC-C18（250 mm4.6 mm5 m）；流动相：体积分数 5%的乙腈水溶液；检测波长：269 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：30。在上述色谱条件下，取对照品溶液、供试品溶液各 10 L 进样，测定。色谱图分别见图 1、2。图 1 水杨苷对照品液相色谱图图 2 白柳皮提取物液相色谱图08.004.0012.002.0010.006.0014.0016.0010.183响应值（AU）0.0700.0600.0500.0400.0300.0200.0100时间/min08.004.0012.002.0010.006.0014.0016.0010.1839.783响应值（AU）0.0700.0600.0500.0400.0300.0200.0100时间/min2.1.4 含量计算采用面积外标法计算样品中水杨苷的含量：含量=%AVWAWVK100001101#其中：A1为样品溶液中水杨苷的峰面积；A0为对照品溶液中水杨苷的峰面积；W1为样品的称样量，mg；W0为对照品的称样量，mg；V1为样品的体积，mL；V0为对照品的体积，mL；K 为对照品的纯度。2.1.5 收率计算白柳皮经提取后准确量提取液总体积，取 2 mL提取液于已干燥称定的蒸发皿中，干燥，精密称定。收膏率=2100%AMmV#-h其中：m 为干燥蒸发皿重量，g；M 为恒重后的总重量，g；V 为白柳皮提取液的总体积，mL；A 为白柳皮原料投料量，g。2.1.6 线性范围考察精密称取水杨苷对照品 20.64 mg 置于 25 mL容量瓶中，加水溶解制成储备液，精密吸取该储第 4 期分析与测评杨世帅，等：正交试验优选白柳皮的提取工艺135www.ffc-备 液 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 分 别 置 于10 mL 容量瓶中，加水至刻度，摇匀，按照 2.1.3的色谱条件平行 2 次测定各自峰面积。以水杨苷对照品的质量浓度为横坐标，平均峰面积为纵坐标，求得回归方程为 Y=2 005.302X 37 097.813，R2=0.999 9。结果表明水杨苷在 82.56 825.6 g/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。2.1.7 精密度试验精密吸取对照品溶液 10 L，按照 2.1.3 的色谱条件连续进样 6 次，测得水杨苷峰面积的相对标准偏差（RSD）为 0.67%，表明仪器精密度良好。2.1.8 重复性试验 取白柳皮粗粉 6 份，每份约 20 g，精密称定，按照 2.1.2 的方法制备供试品溶液，按照 2.1.3 的色谱条件测定水杨苷平均含量为 2.04%，RSD 为0.62%，表明该方法重复性良好。2.1.9 稳定性试验取白柳皮粗粉约 20 g，精密称定，按照 2.1.2的方法制备供试品溶液，按照 2.1.3 的色谱条件分别于 0、2、4、6、12、24 h 测定水杨苷含量，RSD为0.67%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。2.1.10 加样回收率试验取 9 份已知含量的白柳皮粗粉约 0.5 g，精密称定，加入一定量的水杨苷对照品溶液（质量浓度为 2.017 8 mg/mL），按照 2.1.2 的方法制备供试品溶液，按照 2.1.3 的色谱条件进行测定，计算水杨苷的回收率 14-18，结果见表 1。平均回收率为99.68%，RSD 为 0.53%。表 1 水杨苷回收率结果编号取样量/g样品中水杨苷的量/mg对照品加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%10.500 510.160 2 5.044 515.202 999.9999.680.5320.500 710.164 2 5.044 515.253 4100.2930.500 910.168 3 5.044 515.255 6100.2840.501 510.180 5 10.089 120.211 499.7150.501 310.176 4 10.089 120.269 8100.0260.500 810.166 2 10.089 120.203 399.7470.500 610.162 2 15.133 625.042 199.0080.501 110.172 3 15.133 625.050 798.9990.500 210.154 1 15.133 625.051 399.072.2 乙醇提取白柳皮正交试验设计根据单因素试验结果，选择乙醇体积分数、料液质量体积比、提取时间、提取次数为影响因素进行正交试验。称取白柳皮粗粉 100 g，置于500 mL 圆底烧瓶中回流提取，提取液经减压浓缩并干燥，冷却 30 min 后得白柳皮提取物干膏粉末。以水杨苷含量及白柳皮提取物收率作为评价标准，采用加权评分法进行综合评价。由于水杨苷含量和白柳皮提取物收率并不一定成正比关系，故收率的权重系数取 0.2，含量的权重系数取 0.8，综合评分=（收率/最大收率）1000.2+（含量/最大含量）1000.8，以综合评分最高试验组为最佳工艺。利用 SPSS 按 L9(34)设计正交试验表 19-21，试验因素与水平见表 2，混合正交试验设计见表 3。根据表 3 分析可知，第 8 组试验的综合评分最高，提取物中的水杨苷含量最高。为进一步确定各因素对白柳皮提取工艺的影响，对表 3 的正交结果进行方差分析，结果见表 4。从表 4 中 R 值可以看出，各因素对试验结果影响的大小顺序为 B C A D，即料液质量体积比提取时间乙醇体积分数提取次数。由方差分析可知，料液质量体积比对水杨苷含量和白柳皮提取物收率有显著影响。提取时间、乙醇体积分数、提取次数对水杨苷含量和白柳皮提取物收率无显著影响。依据表 3 综合评分结果，结合表 4 方差分析得出表 2 试验因素与水平水平乙醇体积分数（A）/%料液质量体积比（B）提取时间（C）提取次数（D）1601:21 h1 次2701:42 h2 次3801:63 h3 次分析与测评2023 年 8 月香料香精化妆品136www.ffc-表 3 混合正交试验表试验因素ABCD白柳皮提取物收率/%水杨苷质量分数/%综合评分111118.710.4168.912122210.511.9279.94313339.810.3070.46421239.513.8087.495223110.314.6393.18623129.314.5290.72731339.815.4096.118322210.215.9199.439331110.115.7498.39K129.028.028.229.1K229.131.030.129.6K330.129.229.929.5R1.13.01.90.5表 4 方差分析表方差来源平方和自由度均方 RFP显著性乙醇体积分数0.2520.15.285 70.159 1料液质量体积比1.5220.832.571 40.029 8*提取时间0.7320.415.571 40.060 3提取次数0.05201.000 00.500 0误差00总和2.558优选条件，即 A3B2C2D2：4 倍量 80%（体积分数）乙醇溶液，热回流提取 2 次，每次 2 h。当工艺为以上参数时，水杨苷（质量分数）为 15.91%，白柳皮提取物收率为 10.2%。2.3 验证试验 为考察上述工艺的可行性，取 3 份白柳皮药材粗粉约 1 000 g，按照正交试验的优选提取条件A3B2C2D2进行验证试验，分别测定水杨苷含量，计算白柳皮提取物收率，见表 5。结果表明，采用优选的工艺条件提取，白柳皮提取物收率及水杨苷含量均达到预期，提取工艺可行，同时我们比较了采取该工艺和市售其他工艺白柳皮提取物水杨苷的含量（见表 6），采用该工艺的白柳皮提取物水杨苷含量高于市售产品。表 5 验证试验结果试验白柳皮粗粉量/g白柳皮提取物收率/%平均收率/%RSD/%水杨苷质量分数/%平均质量分数/%RSD/%11 000.511.110.91.8315.7815.951.0321 000.210.915.9531 000.210.716.113 讨论白柳皮药用历史悠久，传统医药典籍中记载白柳皮性寒、味苦，具有祛风利湿、消肿止痛等功效 22。现代药理研究发现，白柳皮具有良好的解热镇痛、抗炎、抗菌等作用 23-24。该药理作用与白柳皮所含的水杨酸及其衍生物有关，水杨苷为乙酰水杨酸的前体药物，被誉为天然阿司匹林，它在人体内消化吸收后分解为水杨醇，进而氧化成水杨酸，最终在肝脏内转化成乙酰水杨酸，乙酰水杨酸具有较强的抗炎作用 25。水杨苷具有一第 4 期分析与测评杨世帅，等：正交试验优选白柳皮的提取工艺137www.ffc-定的生理活性，因此，含有水杨苷的白柳皮提取物广泛应用于膳食补充剂、药用原料等领域 26。水杨苷易溶于水，能溶于乙醇。采用传统的水煎煮法，提取温度需控制在 100 左右，生产能耗大。水提液不易贮存，其周转贮存需配建冷藏库，设施投资大。选择乙醇作为提取溶剂，提取温度可控制在 60 80，较水提取的温度低，收率提高，且生产能耗小。乙醇提取液不易霉变，可回收乙醇反复利用。综上所述，乙醇作为提取溶剂具有一定的优势，且提取后在浓缩及干燥等环节脱除，残留量可控。采用乙醇加热提取白柳皮，通过正交试验优化提取工艺，得到最佳提取工艺为 4 倍量 80%（体积分数）乙醇溶液，热回流提取 2 次，每次 2 h。此外，进行了放大验证试验，结果表明该工艺条件稳定、可行。我们也比较该工艺和市售其他工艺白柳皮提取物水杨苷的含量，采用该工艺的白柳皮提取物水杨苷含量为 16.5%（质量分数），高于市售产品。参考文献惠玉虎,王让成.RP-HPLC 法测定白柳皮提取物中水杨苷的1 含量 J.中草药,2004,35(5):524-525.祝星宇,张贻强,陈雨晴,等.柳属植物化学成分及药理作用2 研究进展 J.中草药,2018,49(24):5952-5960.赵红娟,韩立芹,姜盼,等.柳属植物化学成分研究概况 J.3 中国野生植物资源,2010,29(3):10-14.OKETCH R H A,MARLES R J,JORDAN S A,4 et al.United States pharmacopeia safety review of willow bark J.Planta Medica,2019,85(16):1192-1202.SCHMID B,LDTKE R,SELBMANN H K,5 et al.Efficacy and tolerability of a standardized willow bark extract in patients with osteoarthritis:randomized placebo-controlled,double blind clinical trial J.Phytotherapy Research,2001,15(4):344-350.MOHD S,SIDNEY J S.Efficacy and safety of white willow 6 bark(Salix alba)extracts J.Phytotherapy Research,2015,29(8):1112-1116.HOSTANSKA K,JRGENLIEMK G,ABEL G,7 et al.Willow bark extract(BNO1455)and its fractions suppress growth and induce apoptosis in human colon and lung cancer cells J.Cancer Detection and Prevention,2007,31(2):129-139.SABAA 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