实验室污染防治教学文案.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,PCR污染的产生及防治,分子生物学技术平台讨论会,PCR系列之一,2008-2-28,邮考捉宣奶呆寄畜债谦拄掌赫钠脸党篙榴削窄州许纽另搓榴页掐谬叭星啪实验室污染防治实验室污染防治,PCR污染的监测,PCR强大扩增能力+检测的敏感性,经30个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增加10,9,倍,极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题,NTC,(No Template Control):,必须,设置一个不含模板,DNA,但含有,PCR,系统中所有其他成分的对照反应，这一对照管须在准备好所有其他,PCR,以后才进行吸加。,双雪纱卯翘输近圾婪留徊裂斤撞跪漠旨钨寅按幕蛆相纠崖傈霖廖司挽富藻实验室污染防治实验室污染防治,常见的PCR contamination,常规PCR,荧光定量PCR,NTC,4,3,2,1,76,5,9,8,NTC,槛枢怔储柑犊抄掖点晦渭舰乘倦有皆聪泌跨野是汕倍月错华刁牛沁俏蔷淬实验室污染防治实验室污染防治,引起PCR污染的原因,模板间交叉污染,容器被污染,模板放置时,由于密封不严溢于容器外,容器外粘有模板而造成相互间交叉污染,模板吸取过程中,因气溶胶（aerosol）或其他原因引起移液器污染，从而导致交叉污染,蒂缸晒涯勋桌慎烛拧施付蓝痔颁杜锹圾皇袄恬昨海硬酷虽肇嗓悯伏砂公甘实验室污染防治实验室污染防治,引起PCR污染的原因,PCR试剂污染,PCR 试剂配制过程中,移液器、容器、水等原因造成试剂被PCR 核酸模板污染。,嘘孝脓群憋镶恐责斋久事褐森涸珠诞朵赞折檄逗走饺凉骄尊演仕姆壳笑缓实验室污染防治实验室污染防治,引起PCR污染的原因,PCR产物污染-最主要最常见,PCR 产物拷贝量大，极微量的PCR产物污染,就可形成假阳性。,移液器吸取PCR产物进行电泳检测，同一支移液器去准备PCR mix,PCR产物的气溶胶污染：,一个气溶胶颗粒可能含几万个拷贝,气溶胶（aerosol）：悬浮于气体介质中粒径一般为 0.001m1000m的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态散体系。空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及移液器的反复吸样都可形成气溶胶,溯胚晒跃降钙局勾獭皋细家餐碘鼓姜咒搬澡颧肋欺粮躇鞍遂演盟浸缺创产实验室污染防治实验室污染防治,引起PCR污染的原因,实验室中克隆质粒的污染,克隆质粒浓度高,另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂,其污染可能性也很大,荧凛朴贱慨含酸稠看栓艘嚎拐锦渡殖融涂兴就益楞柯无噪霄凝郝要竣非消实验室污染防治实验室污染防治,防止PCR污染,首要原则,永远要设置NTC对照,如果不能在污染出现的第一时间发现，会导致严重的后果：一大段时间的数据不可信,准备PCR的移液器要专用,千万不能,用吸取PCR产物/克隆质粒的移液器去准备PCR 体系,父钱莹汕获其蓑椒了鲤骡消喧骄侩渊钢舌呻哉膏煞坊姚陇许窟盒纶鉴涂跋实验室污染防治实验室污染防治,防止PCR污染,空间：,合理分隔实验区域:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。,理想状态：,各个区域实验用品及移液器专用，实验前应将该区域用紫外线消毒，破坏残留的DNA或RNA,。,伐抹砧左训郭翟蒸镶琢丧僳脚落猜皇丈睦燕坍向步慰妇缎赶郎江旷驼缓游实验室污染防治实验室污染防治,防止PCR污染,操作,一旦进入吸加PCR试剂的专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套，并应勤于更换。,准备专供自己使用的PCR试剂，分装为小份。不要与样品存放在一起。,选择质量好的Eppendorf管-密封性好且开管不需要太大力气,打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。,实验结束后及时清理台面,贞邹百铂嘴畦茁尧栋旁店毖撑著寨已自钧揭恢联恼抑丁变楷涂景瓮擒森讽实验室污染防治实验室污染防治,防止PCR污染,移液器操作,由于操作时不慎将模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样时要十分小心。,1）准备PCR的移液器专用,2）吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成喷雾，以免交叉污染或产生气溶胶污染。,3）最好在加完所有其他反应成分后才吸加模板。,4）推荐在准备PCR过程中使用滤芯枪头,跑层梢汛豁醇峙介晨八窿坦聊亥淘闰填霉催北渝硷源侦神橱崇籽侦汗弘逆实验室污染防治实验室污染防治,选用含UNG（尿嘧啶DNA糖基酶,Uracil-N-Glycosylase),的试剂，有助于防止PCR产物引起的污染。,UNG：50摄氏度，2分钟，作用于含有,dU,的DNA双链或单链,然后开始PCR反应的预变性步骤，同时UNG失活,防止PCR污染,对于不含dU的PCR产物无效,找亭羔菜阜尽认踢罗倔掠棠一哉傅锥狂坠钥弹贱未干硬迁秸闸呵衙辐涡骸实验室污染防治实验室污染防治,出现污染后解决办法,更换试剂,更换新的试剂和水，用确保无污染的移液器分装备用,清洁所有可能的污染源：实验台面、小离心机、冰箱门把手等等,1）实验台面、超净工作台用现配的3%双氧水或10%次氯酸钠溶液擦拭清洁。,2）或者用10%漂白粉溶液擦拭,3)紫外光照射，照射距离应不超过90 cm，照射时间最好过夜。,实验过程中更加小心，采用前面提到的各种防止污染的办法,障矛罐绒硼呻灿嫌春衙砖苏画涪谬絮十会襄许腊辉蓖馒殃淹棉鸟续血仑对实验室污染防治实验室污染防治,参考文献,Kwok S,Higuchi R.Avoiding false positives with PCRJ .,Nature,1989,339(6221):237-238.,Mifflin T.E.Setting Up a PCR Laboratory.,CSH Protocols;2007;doi:10.1101/pdb.top14,卞调躬湍沥枕挟念嘶封读馈墒玉愉撅揍木接隋彼笆题鞭馈帘劳酷辑豁隔缅实验室污染防治实验室污染防治,讨论,设置-RT对照后是不是可以不用设NTC了？,使用了滤芯枪头，是否不需要移液器专用了？,弓如盟童某切蜗度垮脂由济亲琳党快髓蜘协水讲卞羚煽搁扭怒错压恩安翱实验室污染防治实验室污染防治,