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食品生物技术第3章第5节重组DNA导入受体细胞 一、基本概念1克隆（cloning） 即外源基因的无性繁殖，是指将目的基因与载体连接成的重组DNA导入受体细胞，进行扩增和筛选，产生大量重组子的过程。 2受体细胞 又称宿主细胞，是能摄取外源DNA，并使其稳定维持的细胞。分为原核受体细胞（主要是大肠杆菌）、真核受体细胞（主要是酵母菌）动物细胞和昆虫细胞（其实也是真核受体细胞）3感受态细胞 能够吸收游离DNA片段的细菌细胞。4感受态细胞的制备在冰浴中用一定浓度的CaCl2处理对数生长期的细菌，以获得高效转化的感受态细胞。其目的是增加受体菌细胞膜的通透性。 5转化（transformation)遗传性状发生改变的方法； 6转染（transfection） 是将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法。 二、重组DNA导入受体细胞的方法 1. 转化（1）热休克法（heat shock） 简单，但转化效率不高（106-108/mgDNA） （2）电转化法 转化效率高（高于109/mgDNA） 热休克转化 电穿孔转化 将待转化的质粒加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。适用于真核及原核细胞外源DNA的直接导入。2、磷酸钙沉淀法 ？原理： HEPES？缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。从而导入大肠杆菌和哺乳动物细胞。 优点:不需要载体 缺点:依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀 3、脂质体（lipofectin）载体法 脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞 4. 体外包装的噬菌体的转导 （1）体外包装（in vitro packaging） 把重组的噬菌体lDNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的l噬菌体颗粒； （2）转导（transduction） 通过受体菌细胞表面的lDNA接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。 体外包装过程示意图 5、显微注射法(microinjection)直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。（常用于转基因动物的基因转移） 三、植物细胞转化技术1、土壤农杆菌Ti质粒转化法Ti质粒-存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。第一步:植物受伤受伤后分泌的一些物质诱导毒性基因表达。第二步： 感染植物（农杆菌感染伤口）第三步： 毒性基因（vir）表达（virA、virG、virD、virB）第四步： T-DNA转移T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。第五步： 诱导冠瘿瘤T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。2、叶盘法（leaf disk) 叶片消毒-切取部分叶片-农杆菌夜浸泡-诱导分化去分化3、电击法（electroporation) 4、基因枪法（gene gun）:又称高速微型子弹射击法 第六节 重组体的筛选与外源基因的鉴定 筛选：根据载体表型筛选 根据插入报告基因的表型筛选 鉴定：根据重组DNA分子特征鉴定重组子 根据目的基因的转录产物(mRNA)鉴定重组子 根据目的基因翻译产物(蛋白质)鉴定重组子 (一)根据载体表型筛选b-半乳糖苷酶显色反应选择法 原理: 载体上有一段b-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的a片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的b-半乳糖苷酶基因（a片段缺失），可以被IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的b-半乳糖苷酶。 选择过程(二)根据报告基因的表型筛选原理：报告基因多数是酶的基因,或组装在载体上或作为外源基因DNA的一部分,报告基因的表达使得受体细胞具有新的遗传性状。(三)根据重组DNA分子特征鉴定重组子 1. 根据重组DNA分子大小鉴定利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大，从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。2.重组DNA分子酶切电泳筛选法: 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。 3.PCR扩增检测法 原理:PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断 过程a.从重组克隆中提取质粒（或DNA） b.用外源DNA插入片断的引物作PCR c.电泳PCR产物 d.检查是否有PCR产物 e.PCR产物的长度是否与外源基因一致 4. DNA序列分析法5.采用DNA杂交法鉴定 核酸杂交:重组克隆与探针杂交 探针: 是一段与目的基因互补的核酸序列,作为基因探针，必须是单链而且带有容易被追踪和检测出来的标记。 识别标记放射性同位素:32P 或 125I非放射性标记:荧光素 Southern blotting 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。工作原理：从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交,只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。 (2)原位杂交筛选 a.工作原理 根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。b.特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落 6.采用DNA芯片鉴定 DNA芯片:利用反向杂交原理,使固定化的探针阵列与样品杂交,通过荧光扫描和计算机处理,获得样品中大量基因序列及表达信息的一种高通量生物信息分析技术。(四)根据目的基因的转录产物(mRNA)鉴定重组子 Northern blotting 用DNA（或RNA）探针检测RNA样品,主要检测插入片断是否被转录； （五)根据目的基因翻译产物(蛋白质)鉴定重组子 对表达产物的检测1.蛋白质凝胶电泳检测原理:外源基因的表达,使得受体菌总表达产物中增加了外源基因表达的蛋白,电泳图谱会出现新的蛋白条带.2.免疫检测法鉴定蛋白蛋白“杂交”，利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。 A.放射性抗体检测法 B.免疫沉淀检测法 检测分泌型产物 原理:抗原抗体凝集反应 方法: 把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈” 。C.酶联免疫吸附测定 (ELISA)D.Western blotting Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。 3.生物学活性检测原理:利用外源基因表达的蛋白质具有特殊的生物学活性本次课的重点内容：1.概念:克隆、转化、转染、Ti质粒；2. b-半乳糖苷酶显色反应选择法的基本原理 3.鉴定重组子的方法有哪些？4.表型筛选加酶切筛选重组子的流程第七节基因工程新技术一、反义基因技术1反义RNA是指有义（sense）DNA 链转录成的、与特异的靶RNA互补结合并能抑制靶RNA表达的一段序列。2反义RNA技术是指把一段DNA序列以反义方向插入到合适的启动子和终止子之间，然后把此基因构建体转化到受体细胞中去，通过选择培养获得转化生物体的技术。3反义基因转录生成的mRNA可以抑制具有同源性的内源基因的表达，用这种方法可获得特定基因表达受阻而其他不相关基因的表达不受影响的转基因植株。4反义基因技术的特点：（1）反义RNA可以高度专一地调节某一特定基因的表达，不影响其他基因的表达。（2）转化到植物中的反义RNA的作用类似于遗传上的缺陷型，表现为显性，被转化的植物材料不必为纯合体就可表现相应的性状。（3）反义基因整合到植物的基因组中可独立表达和稳定遗传，后代符合孟德尔遗传规律。（4）反义基因不必了解其目的基因所编码的蛋白质结构，可省去对基因产物的研究工作。（5）反义基因不改变目的基因的结构，在应用上更加安全5利用反义基因技术生产反义PG番茄第一步，通过一定的方法得到目的基因PG第二步，构建反义PG基因重组子，即PG基因反向构建到适宜的载体上，如农杆菌Ti 质粒。或者需要通过一个中间载体如大肠杆菌质粒再转移到农杆菌Ti质粒上第三步，利用携带反义PG基因的农杆菌质粒，通过叶盘法进行转化番茄子叶或者下胚轴第四步，被转化的番茄子叶或者下胚轴在含有一定浓度的抗生素培养基上培养，经历愈伤组织形成、发芽、生根等过程，逐渐形成一颗完整植株。第五步，对再生植株进行鉴定，如点杂交、Southern杂交、Northern杂交和性状观察等，检测外源基因是否已经转录、翻译和表达等。第六步，对正确表达目的基因的植株进行选育，获得纯合体后代，通过安全评价程序，进行田间释放、中试和商业化生产。二、RNA干扰Gene koncking out:用胚胎干细胞作为材料,通过外源基因同源重组技术将胚胎干细胞中某段基因置换出来,然后将此胚胎干细胞注入囊胚中形成嵌合体,再通过杂交使外源基因纯合,从而改变生物遗传特性的方法。 Antisense RNA:利用缺乏编码能力的单链RNA分子能特异地与靶RNA互补，结合在mRNA的SD序列和起始密码子处，从而抑制mRNA的翻译, 封闭或破坏靶基因表达的方法。第八节 基因工程在食品产业中的应用 一、改良微生物菌种性能 二、应用于酶制剂的生产三、改良食品加工的原料四、改进食品生产工艺五、应用于生产保健食品的有效成分六、 转基因食品的现状以及我国的对策