基因工程常用工具酶及应用复习过程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程常用工具酶及应用,基因工程的工具酶,定义 用于DNA和RNA切割和连 接的各种酶叫做工具酶。,2,“分子剪刀”的发现者,3,第一节 限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease，RE),是由细菌自己产生的一种能识别双链,DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。,4,在细菌体内，这种内切酶可以分解外源性的DNA物质，例如病毒等；而细菌本身的DNA同一识别序列中的某些碱基被甲基化所保护。这种细菌内部的限制与修饰作用分别由核酸内切酶和甲基化酶完成，构成了类似免疫的防御系统。,5,解释,何谓内切酶,-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-o-,红色为外切酶的作用位点，,蓝色为内切酶的作用位点,6,限制性核酸内切酶的分类,目前已发现的限制性核酸内切酶600余种，可分为三大类。,类,限制性核酸内切酶广泛用于基因工程；,特点：识别切割位点比较专一，只有切割作用。无甲基化修饰作用。,类和类,限制性核酸内切酶同时具有内切活性和甲基化修饰活性，且识别位点复杂，特异性差，不适用于基因工程。,7,一.限制性内切酶的命名,Hind H in d ,细菌属名的第一个字母,细菌种名的前两个字母,细菌菌株的第一个字母,同一菌株中发,现的第三种酶,8,EcoRI E co,R,I,细菌属名的第一个字母,细菌种名的前两个字母,该酶的基因位于R质粒上,该菌株发现的,第一种内切酶,9,10,二.,II型限制酶的识别特点,识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序的固定位置切割，识别顺序为,回文结构,。（Palindrome）,客上天然居,居然天上客,11,12,EcoRI,PstI,HpaI,5,3,3,-G ACGTC-,-CTGCA G-,5,5,3,-G AATTC-,5,3,-CTTAA G-,5,5,3,3,-GTT AAC-,-CAA TTG-,5 sticky end,5粘末端,3 sticky end,3粘末端,blunt end,平末端,三.限制性内切酶的切割方式,13,四.识别位点与切割方式,限制性内切酶识别序列一般为6个核苷酸，如EcoRI，HindIII，BamHI，居多数。,也有少数限制性内切酶，识别序列为4个、5个、或更多的核苷酸如8个及8个以上，当识别序列核苷酸数为单数时，则以中间的核苷酸作为对称轴。如GTNAC（N 代表四种核苷酸）。,14,一般说来，在DNA分子中，识别序列短的出现概率大，识别序列长的出现概率小。有N个核苷酸的识别序列出现概率为1/4,n,。如识别4个核苷酸Sau 3A，则间隔256（4444）个核苷酸就有一次机会出现识别位点。如识别8个核苷酸的Not I，则需间隔65536个核苷酸才有一次机会出现识别位点。,15,稀切酶：有些酶的识别位点在核苷酸序列中出现的几率很小，可称为稀切酶。,为了获得大的DNA片段，需用稀切酶切割。,个别限制性内切酶可识别两种以上的核苷酸序列，如,Acc,I既可识别GTATAC，又可识别GTCGAC。,16,位点偏爱：限制性内切酶识别序列两侧的核苷酸组成与酶切效率有关，比如,Nae,I在pBR322质粒上有4个识别位点，其中两个位点可迅速被,Nae,I切割。第三个位点稍慢。而位于1285处的第四个识别序列，切割的效率只有其他位点的1/15。,17,同尾酶：两种酶识别不同的顺序，但切割 产生的粘末端相同，叫做同尾酶。,同尾酶产生的粘末端，可通过碱基互补连接，形成的位点称为“杂种位点”，该位点不能再被原来的两种酶切割。,18,例：A,GATC,T G,GATC,C,T,CTAG,A C,CTAG,G,Bgl,BamH,A,T,CTAG,GATC,C,G,连接酶,A,GATC,C,T,CTAG,G,19,同位酶:识别相同的序列,但切割位点不同.,同裂酶:又称异源同工酶,，,来源不同,但识别位点和切割位点相同.,切割位点也可以不同，,例如Sam I(CCCGGG)和Xma I(CCCGGG),20,五.,限制性内切酶的反应条件,反应温度 一般为37,o,C,反应体积20,l,DNA含量 0.51,g,酶含量 12u,DNA纯度：OD260/280nm1.7,阳离子 Mg,2+,反应时间 1-1.5h,pH7.5,21,限制性核酸内切酶的反应条件,各种,限制性核酸内切酶反应条件相似，主要区别是对盐浓度的需求不同。据此可分为三组,低盐组 050mmol/L NaCl,中盐组,50100mmol/L NaCl,高盐组 100150mmol/L NaCl,22,限制性核酸内切酶的星号活性,当酶切条件发生变化时，,限制性核酸内切酶的专一性可能会降低，导致同种酶识别多种序列，这种现象称作限制性核酸内切酶的星号活性。,23,例如 EcoR I在正常条件下识别GAATTC,但在低盐（小于50mmol/L)、高pH（大于8）、甘油大量存在时，识别序列增加了AAATTC、GAGTTC,导致EcoR I在DNA分子上的切割位点大大增加。,24,第二节 其他工具酶,一.DNA聚合酶,作用:依据模版,连接游离的单核苷酸,形成与 模版互补的新链。,25,1.大肠杆菌DNA聚合酶,该酶具有三种酶活性,53 DNA聚合活性,35 外切酶活性,识别切除错配的核苷酸,53 DNA外切酶活性,26,5CCGATA,-OH,3,3GGCTATCGGA,5CCGATA,GCCT,3,3GGCTATCGGA,53 DNA聚合酶活性,DNA聚合酶,dNTP,27,5CCG,ATA,-OH 3,3GGC,DNA聚合酶,5CCG,3GGC,dA,dT,35 外切酶活性28,2.大肠杆菌DNA聚合酶大片段,该酶是用枯草杆菌蛋白酶或胰,蛋白酶降解大肠杆菌DNA聚合酶，从全酶中切去 5,3 外切活性的肽段后,产生的一条多肽链，保留了53聚合和35外切活性。,该酶称为,Klenow,酶。也称为 Klenow 片段（Klenow fragment）。,29,3.T4噬菌体DNA聚合酶,来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，具有,53 DNA聚合酶活性,35 外切酶活性,30,4.TaqDNA聚合酶,耐热的 DNA聚合酶。最适反应温度75,80,o,C，主要用于聚合酶链反应。,31,5.逆转录酶,（,reverse transcriptase）,作用：以RNA为模版，合成 cDNA,(Complementary DNA),该类酶有三种活性,RNA依赖的DNA聚合酶活性,DNA依赖的DNA聚合酶活性,外切RNA的活性,32,常用的逆转录酶有两种：,AMV来自于鸟类骨髓母细胞瘤病毒,M-MLV来自于莫络尼鼠的白血病病毒,33,二.T4DNA连接酶,催化,两个,DNA,片段,的3,-OH和5-P末端 形成磷酸二酯键,该酶是大肠杆菌T4噬菌体的DNA30编码的产物，分子量68kd。现已由基因工程菌表达。,34,DNA 连接酶,“分子针线”,35,DNA连接酶,连接的部位：,磷酸二酯键（梯子的扶手），不是氢键（梯子的踏板）。,36,主要功能降解RNA,由于RNA酶分布广泛，如唾液、皮肤分泌物中都含此酶，在涉及RNA的实验中谨防RNA酶污染。,三.RNA酶,37,四.核酸酶SI,降解单链,DNA 或 RNA，形成5,-P的单核苷酸或寡核苷酸片段,对DNA的活性比对RNA的强,产生平末端,38,五.碱性磷酸酶,切除DNA或RNA的5-P,防止DNA自身环化,5,p,TTAGCTAGGCCC TCAATCGGTACG,OH,3,3,HO,-AATCGATCCGGG AGTTAGCCATGC,p,5,39,此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢,