鸡新城疫诊断技术规程.doc

鸡新城疫诊断技术规程
1 范围
本规程引用GB16550-1996新城疫检疫技术规范。
本规程规定了新城疫群体检疫、个体检疫、实验室检验和检疫后处理的技术规范。
本规程适用于鸡和其他可感染新城疫的禽类。
2 群体检疫
对养禽场、独立饲养的禽群及外售、外运的禽群施行检疫。
2.1 查明疫病背景
通过询问兽医人员或检查疫病记录，检查被检禽场（群、室）在过去的一年内是否有出现过新城疫临诊病例，是否有与新城疫接触史，周围2km范围内是否发生过新城疫。
2.2 查清免疫状况
通过查验免疫证明或查询其他资料，检查被检群是否已按规定注射合格疫苗。如按规定免疫并正处于规定的保护期内，禽只健康状况良好，被认为免疫合格。如免疫不符合规定要求，要以合格疫苗再次接种，隔离饲养观察至群体抗体滴度达25以上，全群健康，认为免疫合格；观察期内发现疑似新城疫病禽，须按2.3和2.4条要求进一步检查。
2.3群体临诊检查
首先作静态检查，让禽群处于静止状态，观察营养状况、精神状态、呼吸、粪便、鼻和口腔分泌物有否异常。然后观察禽只运动状况，有否跛行、共济失调、痉挛等异常现象。检查中重点注意以下情况：
a.精神沉郁或无任何症状而死亡；
b.体温升高、食欲减退、精神委顿、产蛋减少或停止；
c.口腔和鼻腔分泌物增多，素囊胀满；
d.呼吸困难、喉部发出“咯咯“声（晚间较明显）；
e.下痢，粪便成绿色；
f.偏头转颈，作转圈运动或共济失调。
若发现疑似病例，按2.4条要求进一步检查，同时对全群隔离饲养。
2.4 病理解剖检查
对临诊疑似病例，应全部或抽样解剖，依据下述病变作出初步判断：
a.口腔、喉部有粘液，咽部粘膜出血；
b.腺胃乳头肿胀，挤压后有豆腐渣样坏死物流出，乳头有散在的出血点；
c.肌胃角质下层有条纹或点状出血、有时见不规则溃疡，腺胃与肌胃交接处有出血斑、条；
D小肠前段有大面积散在出血点，或肠粘膜有纤维性坏死并形成假膜，假膜下出现红色粗糙溃疡；
E盲肠和直肠皱褶处有出血 ，盲肠扁桃体（淋巴滤泡）出血坏死；
F气管粘膜充血、出血、气管内有粘液；
G心冠脂肪、心外膜及心尖脂肪上有针尖状小出血点。
3 个体检疫
3.1在无群体检疫条件的场合，须进行个体检疫。个体检疫合格的禽只一般供食用，如继续饲养应隔离3周，经观察无异常后，方准与其它禽只混养。
3.1.1 查明是否来自疫区。
3.1.2 查验免疫证明。
3.1.3 临诊检查和病理解剖检查
检查内容参照2.3条和2.4条进行，发现疑似新城疫染疫禽只，立即作无害化处理。
4 实验室检验
4.1 下列情况进行实验室检查
a. 产地定期检疫；
b. 监测免疫状态；
c. 疑似病鸡的定性，或临诊及解剖检查初步诊断为新城疫，需进一步确诊；

d. 检疫中发现重大疫情（如禽流感），须作鉴别诊断；
e. 行政主管部门、饲养单位、售购或争议双方要求进行实验室诊断。
4.2 实验室检测方法
a. 病毒分离鉴定试验，见附录A。
b. 血凝抑制试验，用于免疫监测，见附录B。
5. 检疫后的处理
5.1 经临床检查、解剖检查和实验室诊断等综合判断，确诊为新城疫的禽群或禽只，按GB16548处理。
5.2 经初步诊断为新城疫可疑的禽群（禽只），按下述方法之一处理：
a. 除将可疑禽只按5.1条处理外，全群隔离饲养，并进行紧急免疫接种，如在接种后观察期内出现可疑禽只，亦按5.1条处理，观察21天后，对临床健康，免疫滴度达到25以上的禽只，经体表消毒后按健康禽只对待。
b. 经初步诊断为新城疫可疑的禽群（禽只），在全部隔离饲养的同时，对可疑禽只采样作实验室诊断，如确为新城疫者，全群即按5.1条处理。
5.3 发生过新城疫的禽场在半年之内，其禽只不准出售、外运。

附录A 病毒分离鉴定试验

A1仪器设备
注射器：1ml。
注射针头：5—5.5号。
血凝试验板：V型、96孔。
微量移液器：50ul。
恒温箱。
超净工作台或无菌室。
A2试剂。
无菌生理盐水。
青霉素。
链霉素。
标准阳性血清。
A3样品采集及处理
A3.1活禽用气管拭子和泄殖腔拭子（或粪）。
A3.2死禽以脑为主；也可采心、肝、脾、肾、气囊等组织。
A3.3样品用生理盐水研成1：5乳液；拭子侵入2—3ml 生理盐水中，反复吸挤压至无水滴出，弃之。溶液中加入青霉素（使终浓度为1000单位/ ml ）、链霉素（使终浓度为1mg/ml ）。泄殖腔拭子（或粪）样品，青霉素、链霉素量提高5倍。然后调pH 7.0—7.4，37℃作用1h ，再1000r/分钟离心10分钟，取上清0.1ml，经尿囊腔接种9—10日龄SPF鸡胚。
A4培养物的收集及检测
A4.1培养4—7天的尿囊液经无菌采集后-20℃保存.
A4.2尿囊液按附录B作血凝试验，并与标准阳性血清作血凝抑制试验，确定有无 新城疫病毒繁殖。
A4.3MDT（最小病毒致死量引起鸡胚死亡的平均时间）的 测定：将新鲜尿囊液用生理盐水连续10倍稀释，10-6—10-9的 每个稀释度接种5个9—10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，37℃孵化。余下的病毒保存于4℃，8h后 以同样方法接种第二批鸡胚，连续 7天内观察鸡胚死亡时间并记录，测定出最小致死量，即引起被接种鸡胚死亡的最大稀释倍数。计算MDT。
A4.4以MDT确定病毒的致病力强弱，40—70h死亡为强毒，140h以上为弱毒。

附录B 鸡新城疫微量红细胞凝集抑制试验
B1仪器设备
B1.1微量血凝板：V型、96孔。
B1.2微型振荡器。
B1.3塑料采血管。
B1.4移液器：50ul.
B2试剂
B2.1稀释液
pH7.0—7.2磷酸缓冲盐水
氯化钠（GB1266—77） 170g
磷酸二氢钾（GB1274—77） 13.6g
氢氧化钠（GB629—77） 3.0g
蒸馏水 1000ml
高压灭菌，4保存，使用是作20倍稀释。
B2.2浓缩抗原
B2.3 0.5%红细胞悬液
采成年鸡血，用20倍量磷酸缓冲盐水洗涤3—4次，每次以2000r/min离心3—4分钟，最后一次5分钟，用磷酸缓冲盐水配成0.5%悬液。

B2.4标准阳性血清
B3被检血清
每群鸡随机采20—30份血样，分离血清。
采血法：先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至6~8cm长。将管一端烧融封口，待凝固析出血清后以1000r/min离心5分钟，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中，若需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端剪去，滴融化石蜡封口，于0oC保存。
B4 操作方法
B4.1 微量血凝试验
B4.1.1 于微量血凝板（B1.1）的每孔中滴加稀释液（B2.1）50ul，共滴四排。
B4.1.2 吸取1:5稀释抗原滴加于第一列孔，每孔50ul，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11孔各吸取50ul弃之。最后一列不加抗原作对照。
B4.1.3 于每孔加入0.5%红细胞悬液（B2.3）50ul。
B4.1.4 置微型振荡器（B1.2）上振荡1分钟，或手持血凝板绕圆圈混匀。
B4.1.5 放室温下（18~20oC）30~40分钟，根据血凝图象判定结果。以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。每次四排重复，以几何平均值表示结果。
B4.1.6 计算出含4个血凝单位的抗原浓度，按式（B1）进行计算。
抗原应稀释倍数=血凝滴度/4……………………..(B1)
B4.2 微量血凝抑制试验
B4.2.1 先取稀释液（B2.1）50ul，加入微量血凝板（B1.1）的第一孔，再取浓度为4个血凝单位的抗原依次加入3~12孔，每孔50ul，第二孔加浓度为8个血凝单位的抗原50ul。
B4.2.2吸被检血清(B3)50ul 于第1孔(血清对照)中,挤压混匀后吸50ul 于第2孔,依次倍比稀释至12孔,最后弃去50 ul.
B4.2.3置室温(18—20℃)下作用20分钟.
B4.2.4滴加50ul 0.5%红细胞悬液(B2.3)于各孔中,振荡混合后,室温下静置30—40分钟,判定结果
B4.2.5每次测定应设已知滴度的 标准阳性血清(B2.4)对照.
B5结果判定
B5.1在对照出现正确结果的情况下,以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度.
B5.2若有10%以上的鸡出现11(log2)以上的高血凝抑制滴度,说明鸡群已受新城疫强毒感染.
B5.3若监测鸡群的免疫水平,则血凝抑制滴度在4(log2 )的鸡群保护率为50%左右;在4(log2)以下的保护率达90%--100%;在4(log2)以下的 非免疫鸡群保护率约为9%,免疫过的鸡群约为43%.鸡群的血凝抑制滴度以抽检样品的血凝抑制滴度的几何平均值表示,如平均水平在4(log2 )以上,表示该鸡群为免疫鸡群.