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免疫学检验中的酶免疫技术

       20世纪中期，以放射免疫技术为代表的标记免疫技术相继问世，它将某种可微量或超微量测定的物质（如放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂等）标记于抗原（抗体）上制成标记物，加入到抗原抗体的反应体系中与相应的抗体（抗原）反应，以检测标记物的有无及含量间接反映被测物的存在与多少。这些将标记技术与抗原抗体反应结合起来的免疫学检测技术以其敏感性高、准确性好、操作简便、易于商品化和自动化等特点逐渐替代了凝集、沉淀等经典的免疫学检验技术，不仅用于抗原、抗体、补体、免疫细胞、细胞因子等免疫相关物质的检测，也用于酶、微量元素、激素、微量蛋白等体液中各种微量物质的检查，可以说一切具有抗原性或半抗原性的物质原则上均可利用现代免疫检验技术进行检测，使免疫学检验渗透到医学的各个领域。
    目前，免疫学检验中的标记技术主要包括酶免疫技术、荧光免疫技术、放射免疫技术、金免疫技术、化学发光免疫技术等。其中酶免疫技术是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术。作为经典的三大标记技术之一，酶免疫技术在检验医学中得到广泛应用并不断得到更新。
一、常用的酶及显色底物
    在酶免疫技术中用于标记的酶应具有催化活性高、催化专一性强；与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体的免疫反应性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物产生的信号产物易于观察和检测；对人无害且价廉、易得等特点，目前常用的酶及底物见表1。
表1 常用酶及底物
常用酶
底物
加终止液前颜色
加终止液后颜色
辣根过氧化物酶（HRP）
RZ>3.1
碱性磷酸酶（AP）
邻苯二胺（OPD）
四甲基联苯胺（TMB）
对硝基苯磷酸酯（p-NPP）
橙黄色
蓝色
黄色
棕黄色
黄色
黄色

二、标记物的制备
    在酶免疫技术中制备标记物的抗原应纯度高、抗原性完整；制备标记物的抗体应特异性好效价高、亲和力强、比活性高、能批量生产和易于分离纯化。
制备酶标记物的方法应符合简单、产量高；避免酶、抗体（抗原）、酶标记物各自形成聚合物；标记反应不影响酶的活性和抗原抗体的免疫反应性等原则。标记物制备的方法基本属于两类：
（一）   交联法
    交联法是以一可同时与酶和抗体（抗原）结合的 交联剂作为“桥”，分别连接酶与抗体（抗原）的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联法，形成的结合物为：酶-戊二醛-抗体（抗原）
（二）   直接法
    直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形成标记物，如过碘酸钠法。形成的结合物为：酶-抗体（抗原
三、酶免疫技术类型
    酶免疫技术按照抗原抗体系统是定位于组织细胞上还是存在于液体样品中分为酶免疫组化技术和酶免疫测定（EIA），酶免疫测定又可分为均相酶免疫测定和异相酶免疫测定。
（一）   均相酶免疫测定
    均相酶免疫测定是利用酶标记物结合成抗原抗体复合物后，标记酶的活性就受到抑制，因而反应后不需分离结合的和游离的酶标记物，直接测定系统中的总标记酶的活性的变化，即可确定结合的酶标记物的数量，从而得到待测物的含量的一种技术。常用于半抗原或小分子抗原如药物、激素、毒品、兴奋剂等的测定。常用的技术类型有：
      1．酶免疫增强测定技术（EMIT）：酶免疫测定增强技术中酶活性的抑制是由于标记抗原与抗体结合后空间位阻了酶与底物结合的部位而造成的。反应模式常用竞争法，即当未标记抗原多，竞争性的与抗体结合多，则标记抗原与抗体结合少，酶的活性受到抑制少，酶活性高。因此，最终测得的酶活性与未标记物的含量呈正相关。见图1。

     2．克隆酶供体免疫分析（CEDIA）：克隆酶供体免疫分析中酶是以供体和受体两个片段存在的，只有两个片段结合在一起形成全酶才能具有活性，当标记了供体酶的抗原与抗体结合后就空间位阻了酶供体（ED）与酶受体（EA）的结合，从而不能形成有活性的全酶，酶活性受到抑制。在反应模式上同样为竞争性结合分析方法，最终测得的酶活性与未标记抗原的含量呈正相关。见图2。

（一）   异相酶免疫测定
    异相酶免疫测定与均相酶免疫测定的最大区别是抗原抗体反应平衡后，在反应体系中同时存在着游离的和结合的两种酶标记物，两种标记物上的酶都具有酶活性，而只有结合的酶标记物的形成与含量才代表待测物的存在与含量。因此，需将游离的和结合的酶标记物分离，测定结合状态的酶标物的活性推算待测物的含量。因分离游离和结合的标记物的方法不同，异相酶免疫测定又分成液相酶免疫测定和固相酶免疫测定两类方法。液相酶免疫测定，由于游离的和结合的标记物都存在于液相中，故需用分离剂将二者分开后才能测定结合状态的酶标记物的活性。而固相酶免疫测定，是通过载体将结合状态的酶标记物吸附在固相支持物上，只需洗涤就可将游离的酶标记物去除。目前固相酶免疫测定以酶联免疫吸附试验（ELISA）为最常用。

一、酶联免疫吸附试验（ELISA）
（一）   基本原理
    酶联免疫吸附试验的基本原理是将过量抗体（抗原）包被于载体上，通过抗原抗体反应使酶标记抗体（抗原）也结合在载体上，经洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后，加入底物显色，定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术。
（二）   技术类型
     酶联免疫吸附试验的主要技术类型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。
   1．各种技术类型的原理如下：双抗体夹心法用于检测抗原。它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。
    间接法用于测定抗体。它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。
    竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。
    捕获法用于测定IgM类抗体。固相载体上连接的是IgM的二抗，先将标本中的IgM类抗体捕获，防止IgG类抗体对IgM测定的干扰，此步骤也是其称为捕获法的原因所在，然后再加入特异抗原和酶标抗体，形成抗体IgM-IgM-特异抗原-酶标抗体的复合物，复合物含量与待测IgM成正比，也属非竞争性反应类型。
   2.各种技术类型的主要区别：见表2 。
表2 ELISA常用技术类型比较
类型
固相载体上
的包被物
待测物
酶标记物
显色程度与待测物含量间的关系
双抗体夹心法（一步法）
抗体A
抗原
酶标抗体B
正相关
间接法
抗原
抗体
酶标二抗
正相关
竞争法
抗原（抗体）
抗体（抗原）
酶标抗体（抗原）
负相关
捕获法
抗IgM
IgM
酶标抗体
正相关

（三）   技术要求
     1.常用的固相载体：ELISA中最常用的固相载体用聚苯乙烯制备，可制成微量反应板、小试管和小株，现多用微量反应板，它吸附性能好、空白值低、孔底透明度高、批间稳定性好、价格低廉且易于与自动化仪器配套。另外，聚乙烯、聚氯乙烯酰胺等塑料制品也有使用。除塑料外，还可使用膜载体（如硝酸纤维素膜磁化微颗粒等。
     2．固相包被物的制备：固相包被物的制备方法可以是吸附或化学偶联。用聚苯乙烯做载体包被抗原（抗体）常用吸附的方法。4℃过夜或37℃2～6h经清洗后即可应用。为防止包被后载体上留有未包被的空隙而导致本底过高，常用1％～5％牛血清白蛋白封闭空隙。
     3．最佳工作浓度的选择：在酶联免疫吸附试验中为防止本底高和灵敏度低，需要对包被抗体（抗原）和酶标抗体（抗原或二抗）进行滴定和选择最佳工作浓度。如夹心法最佳工作浓度的选择是用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。如表三所示包被抗体选择3个浓度酶标抗体也选择3个浓度分别与包被抗体的3个浓度配伍，然后分别加入强阳性抗原、弱阳性抗原和阴性对照，得到27个A值，以强阳性抗原A值在0.8，阴性对照A值<0.1为最佳工作条件，按照表3的测定结果可知包被抗体的最佳工作浓度是1mg/L，酶标抗体的工作浓度是1：5,000。
表3 双抗体夹心法包被抗体和酶标抗体工作浓度选择的棋盘法
包被抗体的浓度
酶标抗体稀释度
强阳性抗原
弱阳性抗原
阴性对照
10mg/L
1:1000
1.20
0.16
0.08
1:5000
0.48
0.04
0
1:25000
0.13
0
0
1 mg/L
1:1000
>2
0.26
0.10
1:5000
0.90
0.12
0.01
1:25000
0.24
0.01
0
0.1 mg/L
1:1000
0.43
0.13
0.12
1:5000
0.11
0.04
0.02
1:25000
0.03
0
0

二、酶免疫技术的发展
    酶免疫测定具有高度敏感性、特异性，而且它的试剂比较稳定，操作简单且无放射性危害，特别是商品试剂盒和自动化仪器的应用，使其成为一种适用于各级检验部门的免疫标记技术。随着检验医学的不断发展，酶免疫测定的方法、技术也得到发展和更新，斑点-ELISA、发光酶免疫测定、免疫印迹法、BAS-酶联免疫吸附试验等方法不断得到应用。
（一）斑点-ELISA
    斑点-ELISA的原理与ELISA的区别在于用对蛋白质有极强吸附力的硝酸纤维素膜代替塑料制品作为固相载体，酶作用底物后在硝酸纤维素膜上形成有色沉淀而使膜着色。它的灵敏度较一般ELISA高6～8倍、可达ng水平，试剂用量小，不需其它设备条件。
（二）免疫印迹法
    免疫印迹法是将电泳与ELISA结合起来的一种方法。它先经十二烷基磺酸钠-聚苯烯酰胺凝胶电泳将样品进行分离，通过转印将被分离的各区带原位转移到硝酸纤维素膜上，然后把印有蛋白质条带的膜当成包被抗原的固相载体，做酶免疫测定。所以它的方法分为电泳、转印、酶免疫测定三个阶段。免疫印迹法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样品组分的免疫学测定方法。
（三）发光酶免疫测定
    发光酶免疫测定与一般EIA的区别是酶所催化的底物是发光剂。产物不是一般EIA的有色物质，而是发光产物，所发出的光可用特定的仪器测定。常用的酶是HRP和AP，HRP的发光底物有鲁米诺及衍生物、对-羟基苯乙酸；AP的底物为3-（2-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-(3-磷酸氧基)-苯基-1，2-二氧乙烷和4-甲基伞形酮磷酸盐。
（四）BAS-酶联免疫吸附试验
      BAS-酶联免疫吸附试验是将生物素-亲和素（BAS）放大系统与ELISA结合起来的一种技术。生物素（B）是一种小分子的生长因子，有两个环状结构，其中一个可以和亲和素结合，另一个可以和包括酶、抗原（抗体）的多种物质结合。亲和素（A）又称卵白素，有4个亚基，都可与生物素稳定结合，此为放大系统的关键，即有1个亲和素就能结合4个生物素，亲和素也可被酶标记。
    在BAS的应用中正是利用了生物素和亲和素的这些特点，设计了两类反应类型：一类是以游离亲和素为“桥”，分别连接生物素化抗原抗体反应系统和酶标生物素。此种类型有BAB法和ABC法，另一类是直接用标记亲和素连接生物素化抗原抗体反应系统，此种类型有BA法。以双抗体夹心法测抗原为例，各种类型的反应式表示如下。
       BAB法的反应式可表示为：固相抗体＋待测抗原＋抗体-生物素＋亲和素＋生物素-酶＋底物。
       ABC法的反应式可表示为：固相抗体＋待测抗原＋抗体-生物素＋亲和素＋生物素-酶-底物。
       BA法的反应式可表示为：固相抗体＋待测抗原＋抗体-生物素＋亲和素-酶＋底物。
    这种通过BAS放大作用可将更多的酶聚集在固相载体上，使酶免疫技术检测的灵敏度进一步得到提高。

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