中枢神经系统原发性淋巴瘤基因表达多态性分析及人源性B细胞淋巴瘤株对干预因素相关性的实验研究.ppt

1中枢神经系统原发性淋巴瘤基因表达谱多态性分析、人源性B细胞淋巴瘤株建立及对干预因素反应的实验研究神经外科神经外科 王亚明王亚明2013-03-202013-03-202研究必要性PCNSL占所有原发颅内肿瘤的3%-5%。流行病学资料显示：PCNSL的发病率近年来明显增高。在我科，每年立体定向活检病理证实病例约50例左右。已经留存约140例福尔马林固定标本，10余例液氮冻存标本，每月新增5例左右的新鲜标本。3研究背景1PCNSL是一种具有明显分子异质性的疾病，依照基因表达谱的特征，常为两种类型：具有正常生发中心 B 细胞基因表达特征的生发中心细胞型(germinal center B-cell like,GCB)，表达 CD10、bcl-6、Lmo-2、A-myB、JAW1等，致病机制涉及 bcl-2 癌基因(t14；18)染色体的移位；具有活化B细胞基因表达模式的活化细胞型(activated B-cell-like，ABC)或非生发中心型(non-germinal center B-cell like，non-GCB),表达MUM1/(IRF-4)、FOXP1、cyclinD2、Flip 等，发病机制涉及 NF-KB 的活化。叶酸代谢通路上的几个关键酶的遗传多态性（亚甲基四氢叶酸脱氢酶，MTHFD1；亚甲基四氢叶酸还原酶，MTHFR；胸苷酸合成酶，TYMS）会影响MTX的药代动力学和淋巴瘤的疗效 目前对其基因突变研究少，可采用CDNA微列阵技术分析其基因表达多态性4研究背景2淋巴瘤基因表达变异多，涉及多个癌基因和抑癌基因Survivin基因（凋亡抑制蛋白家族）、免疫球蛋白 V(IgV)基因、体细胞突变(SHM)、凋亡抑制基因-2（API2）、淋巴瘤相关易位基因（MALT)、Bcl-2、Bcl-10、FOXP1(foekhead box protein P1）基因、Bcl-6(生发中心型）、TCR基因、X-box 结合蛋白-1（XBP-1，信号通道的调节器、PTPRK基因、信号转导和转录激活因子6（STAT6）等。与化疗药物耐受相关的基因：GST（酸性谷胱甘肽-s-转移酶）编码基因、DNA拓扑异构酶topo-2编码基因；与放疗相关基因：XRCC1基因-DNA修复基因(x-ray repair cross-complementing group）等 5研究背景3目前PCNSL治疗涉及多种化疗方案，选用化疗药物众多（CTX、MTX、chop方案、利妥昔单抗、洛莫司汀、甲基苄肼，替莫唑胺等），对药物反应存在个体差异，需要建立PCNSL淋巴瘤株来研究不同干预因素（包括放疗）对肿瘤的影响以及对致瘤机制进行单因素分析。目前没有人源性PCNSL的瘤株现有的商品性淋巴瘤株均来源于造血系统肿瘤，人源性Namalwa、Ramos 和 Raji 细胞系（JCRB 公司）、Toledo 和 Pfeiffer 细胞系（ATCC公司）、鼠源性B 细胞淋巴瘤细胞株 A20。本研究利用采集新鲜PCNSL标本在裸鼠上组织块接种后培养纯化出PCNSL瘤株对瘤株采取相关的干预性研究6课题研究的主要内容（一）PCNSL基因表达多态性检测：一、立体定向活检留取50例PCNSL肿瘤样（液氮冻存）；入选标准：1、免疫力人群。有免疫缺陷的患者，如HIV感染等除外；2、有系统淋巴瘤存在着除外；3、所有标本行常规病理检测，依据标准2008版，包括HE染色及免疫组化分析，确认为PCNSL；7课题研究的主要内容（一）二、提取DNA:1、从新鲜冷冻PCNSL肿瘤标本中，提取试验组DNA。2、留取健康男性外周血，利用淋巴细胞分离液，提取出淋巴细胞，利用免疫磁珠的方法，提取出B淋巴细胞。3、从健康男性的B淋巴细胞中，提取对照组DNA。8课题研究的主要内容（一）三 微阵-比较基因组杂交（aCGH）：1、Agilent 人类基因组比较基因组杂交微阵芯片（规格是Kit 1244k）2、按照芯片的试剂盒标准操作流程，实施试验样本与对照样本的杂交。3、按照Agilent单色微阵基因表达分析的实验方案实施。4、基因表达分析：利用Agilent CGH 分析软件识别变异的基因组，确定候选基因。将候选基因输入到DAVID生物信息库，提取这些基因的特征以及功能。9课题研究的主要内容（一）四、聚合酶链反应（RT-PCR）：提取肿瘤标本和正常人群B细胞得到的RNA、DNA，PCR扩增后分析其B细胞的克隆性，检测免疫球蛋白克隆性重排、各种候选基因的变异、基因重排和染色体异常，评价候选基因在不同类型PCNSL中的多态性表达，推断基因突变在成瘤机制中的作用。10课题研究的主要内容（二）人源性PCNSL淋巴瘤细胞株的纯化培养立体定向活检无菌取材新鲜活体瘤组织（很少量标本），选取无坏死、无出血的部分用灭菌盐水洗净，修剪成1mm3小块，接种于BALB/C的裸鼠皮下，形成0.5cm皮丘。待荷瘤长大后，取瘤，分离，剪碎后，做成细胞悬液，接种在10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中进行原代培养，待生长足够量后，用磁珠单抗的进行分离纯化培养，并进行免疫组化标记鉴定。11课题研究的主要内容（二）对培养的人源性PCNSL淋巴瘤细胞株进行干预性研究检测各种化疗药物的毒性反应，耐药基因的检测，GST、Topo异构酶的检测，不同新药的组合及体外反应。检测各种癌基因、抑癌基因的突变培养皿生长肿瘤对放疗反应，DNA修复基因突变的检测等。为临床治疗提供理论依据。12