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单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,第十七章,分子诊断的其它应用,生化与分子生物学学科,2012.4,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,第一节,分子诊断在移植配型中的应用,HLA,的分子生物学分型,第二节,分子诊断在法医学鉴定中的应用,第三节,单核苷酸多态性分析,第一节,分子诊断在移植配型中的,应用,HLA,的分子生物学分型,一、,HLA,遗传学基础,Human leucocyte antigen,人类白血病抗原,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,一、,HLA,与器官移植,基本概念,组织相容性,histocompatibility,）,器官或组织移植时供者与受者相互接受的程度，不相容就会出现,排斥反应,（,rejection,），诱导排斥反应的抗原称为,组织相容性抗原,，也称为,移植抗原,。,主要组织相容性抗原,（,MHA,）,主要组织相容性抗原,Major histocompatibility antigen,次要组织相容性抗原,人类白细胞抗原,HLA,Human leukocyte antigen,其中与移植排斥有关的主要为,HLA-,类和,类抗原。,主要组织相容性复合体,（,MHC,）,编码,MHA(,在人为,HLA),的基因是一组呈高度多态性的基因群，集中分布于染色体上的特定区域，称为,主要组织相容性复合体,（,major histocompatibility complex,，,MHC,），,MHC,编码的产物称为,MHC,分子,。,抗原,免疫系统 抗原肽,MHC/,分子复合物,免疫应答,CD4,+,/CD8,+,T,细胞,（细胞免疫、体液免疫）,抗原性异物排除,MHC,分子为,T,细胞分化发育所必需,MHC,分子为免疫应答的启动和调节所必需,(,一,)MHC/HLA,的基因组成,人类的,MHC,又称为,HLA,基因复合体,，位于第,6,对染色体的短臂,6p21.3,上，约,4000kb,。,HLA,基因有七大类,：即,A,，,B,，,C,，,D,，,DR,DQ,，,DP,。这七大类座位内又有不同的位点。,根据编码分子的功能和分布的不同，可将,整个复合体的基因分成三类,：,类、,类和,类基因。,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,HLA,基因的分类,分类,基因座位,类基因,HLA-A -B -C,HLA-E -F -G -H -X,类基因,HLA-DP -DQ -DR,HLA-DN -DO -DM,类基因,位于,和,类基因之间主,要编码某些补体和炎症因,子（如：,C4A,，,C4B,，,C2,，,Bf,等补体组分）,HLA,抗原分布,HLA-I,类抗原,分布于有核细胞表面；,HLA-II,类抗原,主要表达在活化的,M,、,B,细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞，血管内皮细胞及活化的,T,细胞表面。,HLA-III,主要是一些补体成分：如,C2,、,C4,、,Bf,等。,MHC class I,proteins form a functional receptor on most nucleated cells of the body.,There are 3 major and 2 minor,MHC class II,proteins encoded by the HLA.The genes of the class II combine to form heterodimeric()protein receptors that are typically expressed on the surface of antigen presenting cells.,（二）,HLA,的遗传特点,1,单倍型遗传,haplotype,由于一条染色体上,HLA,各位点的距离非常近，很少发生同源染色体之间的交换，因此亲代的,HLA,以单倍型为单位将遗传信息传给子代。,A,B,a,b,G,H,g,h,A,B,G,H,A,B,g,h,a,b,a,b,G,H,g,h,（,1,）,（,2,）,（,3,）,（,4,）,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,2,共显性遗传,共显性,（,co-dominance,）是指某位点的等,位基因均能同等表达，二者的编码产物都可在细胞表面检测到。,多数个体的,HLA,位点都是,杂合子,，但当父亲和母亲在某位点上具有相同的等位基因时，其子代的这个位点就成为,纯合子,。,Codominant expression of HLA genes,3,连锁不平衡,理论上，一个,HLA,位点的等位基因与另一,个或几个位点的等位基因在某一单倍型出现的频率应等于各自频率的乘积。然而实际情况是，在不同的地区或不同的人群，某些基因相伴出现的频率特别高，这种现象称为,连锁不平衡,。,已经发现某些疾病的发生与,HLA,复合体中某些特定的等位基因密切相关。,二、分子生物学分型法,1.RFLP,与,PCR-RFLP,分型法将目的基因片段,PCR,扩增后，利用多种,限制性内切酶对扩增产物进行酶切，不同的基因序列会产生不同的酶切产物，从而产生不同的电泳图谱。它以简单、敏感、准确，无需同位素等优点成为目前较常用的,HLA,基因分型技术之一，但是无法分辨杂合子，且只能区分有限的多态性。,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,2.,PCR-SSP,分型法,等位基因特异性,PCR,（,ASPCR,）,设计出一整套等位基因组特异性引物,（,sequence specific primer,SSP,），借助,PCR,技术获得,HLA,型特异的扩增产物，可通过,电泳直接分析带型决定,HLA,型别，从而大大简化了实验步骤。优点是简单易行,分辨率可从低到高,成本低。缺点是不易自动化,;,不能检测新的等位基因，试剂盒需不断升级。,3.,PCR-SSCP,分型法,如果二个,HLA,等位基因存在点突变，经,PCR,扩增后进行聚丙烯酰凝胶电泳，因其序列的差异形成不同的空间构象，则电泳迁移率也不一样，如此可将它们区别开。,PCR-SSCP,作为,PCR-SSO,的补充，有助于新的,HLA,等位基因或突变体的发现，在区分纯合子和杂合子基因方面有其独到之处。,4.,SBT,分型法,SBT,分型法,基于序列的,HLA,分型法,(,S,equence-,B,ased HLA,T,yping,),，是通,过对扩增后的,HLA,基因片段进行核酸序列测定，从而判断,HLA,型别的方法。,以上各个方法都存在一些缺陷，如能配合,使用，则能大大提高分型能力。,5.,基因芯片技术,我国生物芯片技术获得重大突破！由军事医学科学院放射与辐射医学研究所王升启研究员领导的课题组，与深圳益生堂生物企业有限公司联合研制的,HLA-DRB1,分型基因芯片试剂盒,，于,2005,年,9,月获得了由国家食品药品监督管理局（,SFDA,）颁发的新药证书和生产文号。这是在国家自然科学基金重点项目和,863,计划的资助下，基因芯片技术应用的又一里程碑式的重大成果。,移植配型,(,又称为,HLA,配型,/,组织配型,):,指在器官移植中检验,供受者,之间移植抗原（HLA,）是否相配的一系列措施。目前主要检测的是,ABO,抗原系统和,HLA,抗原系统。,HLA,抗原系统,主要进行,HLA-A,、,HLA-B,和,HLA-DR,三对位点的配型，只有两个个体的,HLA,配型完全相同才能进行造血干细胞移植，否则会发生移植排斥反应。,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,三、,HLA,配型在器官移植中的应用,理论上说，同胞兄弟姐妹中有,1/4,的机会,HLA,配型,完全相合,；子女与父母之间只有一半,HLA,抗原相同，医学上叫做,半相合,，通常不能,相互移植。所以骨髓移植主要在同胞兄弟姐妹之间进行。,常见的,HLA,分型，在,300,500,人就可以找到相同者少见的,HLA,分型可能是万分之一的机率，而罕见的就要到几万甚至几十万的人群中寻找。,HLA,抗原系统,可通过,血清学方法,、,细胞学方法,、,分子生物学方法,来检测,。,血清学分型,借助的是,微量淋巴细胞毒试验,或称,补体依赖的细胞毒试验,。取已知,HLA,抗血清加入待测外周血淋巴细胞，作用后加入兔补体，充分作用后加入染料，着染的细胞为死亡细胞，依据特异性抗体介导的补体系统对靶细胞溶解的原理，待检淋巴细胞表面具有已知抗血清所针对的抗原。,细胞学分型技术,指的是通过,纯合分型细,胞及预致敏淋巴细胞试验,对,HLA,分型。二种方法的基本原理均是判断淋巴细胞在识别非己,HLA,抗原决定簇后发生的增殖反应。由于分型细胞来源困难以及操作繁琐，细胞学分型技术正逐渐被淘汰。,流式细胞术,取之,分子生物学分型法,利用,PCR,技术将少量目的,DNA,大量扩增，然后再进行产物鉴定的方法，特点是灵敏度高，应用范围广等特点。,寻求与受者,MHC,相配的供者组织或器官,1),ABO,血型相容试验：,2),淋巴细胞毒交叉试验（,MLR,）：,+,不宜移植,受者血清,+,供者淋巴细胞,-,可行,3),HLA,定型或配型试验,非家庭配型：表现型相同,MHCII(HLA-DR),配合优于,MHCI,类,HLA-DR,和,HLA-DQ,间的连锁不平衡,第二节,分子诊断在法医学鉴定中的应用,提要：,一、,PCR,技术在法医鉴定中的应用,二、,DNA,指纹图谱技术,三、,STR,位点分析,四、,DNA,数据库的建立与,DNA,数据交换,五、性别鉴定与,Y,基因检测,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,分子生物学的优点：,（,1,）检材广泛，稳定性高,（,2,）方法灵敏,（,3,）高概率认定,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,一、,PCR,技术在法医鉴定中的应用,亲子鉴定,：指在对父母和子女之间的亲生关系（或称为生物学关系）有所怀疑时，进行遗传关系方面的检查，以便确定亲子关系是否存在，又称为,亲权鉴定,。,个体识别,：,又称个人同一认定,。,虽然二者的鉴定目标不同，但使用的方法是一样的。,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,DNA,提取,如果相匹配，将,HLA,分型与群体数据库进行比较,发出案例报告，,并给出随机匹配的概率,DNA,定量,多个,STR,标记,PCR,扩增,待检样本,HLA,分型与其它结果的比较,PCR,产物的分离与鉴定,确定,HLA,分型,图,15-1,生物物证分析中,HLA,基因分型鉴定流程图,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,二、,DNA,指纹图谱技术,一个,DNA,指纹能同时检测十几个甚至几十个位点的变异，反映的基因组信息非常丰富,DNA,指纹图谱由多个高变位点上的等位基,因形成，具有更高的特异性,严格遵循孟德尔遗传规律，遗传性简单稳定,DNA,指纹图谱具有体细胞稳定性,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,三、,STR,位点分析,STRs,是首选的群体遗传学和法医学研究的遗传标志物,美国联邦数据库,（,Combined DNA Index System,CODIS,）公布的,13,个,STR,位点,：,D3S1358,、,VWA,、,FGA,、,D8S1179,、,D21S11,、,D18S51,、,D5S818,、,D13S317,、,D7S820,、,D16S539,、,THO1,、,TPOX,、,CSF1PO,AMEL,（,性别确定基因）,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,AMEL,（,性别确定基因）,The gene for,amelogenin,（,牙釉蛋白,）,can be used in sex determination of samples from unknown human origin through the Polymerase Chain Reaction(PCR).Using primers specific for intron 1 of the gene,the gene sequence for the intron can be amplified.,The X chromosome gene,AMELX,gives rise to a,106 bp,amplification productamplicon)and the Y chromosome gene,AMELY,a,112 bp,amplicon.Hence,the AMELX contains a 6 bp deletion in the intron 1.,优势,CODIS,已经广泛地应用于法医,DNA,分析,STR,等位基因可以采用商业化试剂盒进行快速检测,其数字化信息适于建立计算机资料库,全球化的实验室可以促进分析不同人群的,STR,等位基因频率,可以用很微量的,DNA,进行,STR,分析,STR,位点分析的检测方法,直接荧光标记后进行毛细管电泳,PCR-RFLP,PCR-,单链构象多态性（,PCR-SSCP,探针杂交等多种方法,四、,DNA,数据库的建立与,DNA,数据交换,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,五、性别鉴定与,Y,基因检测,Y,基因检测试剂盒,同时检测,7,个多态性位点：,DYS390,、,DYS389,、,DYS385,、,DYS19,、,DYS389,、,DYS391,、,DYS392,操作简单,方便更科学地识别人种和族谱,帮助识别亲属关系，包括远亲,能快速识别混合样本中的男性基因,可利用法医基因数据库进行基因物证鉴定,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,六、线粒体,DNA,分析,优势,母系遗传,进化速度快,突变率高等,1,灵敏性高,2,准确性高,3,多态性丰富,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,通过对刑事案件现场遗留的生物检材进行线粒体,DNA,测序或者片段分析：,直接认定或否定犯罪嫌疑人,认定死亡时年龄,进行性别鉴定,思考题,分子诊断在移植配型中的应用,分子诊断在法医学鉴定中的主要应用,全国高等医药院校教材,-,分子诊断学,