弓形虫病诊断.doc

应用弓形虫病诊断试剂盒对新疆部分
地区牛、牦牛和马弓形虫感染的
血清学调查
热孜万古丽.阿布都拉
摘要:弓形虫病是一种分布广泛危害严重的人兽共患病,不但在公共卫生上有很重要的意义,对畜牧养殖业也可引起巨大的经济损失。目前，新疆对牛、牦牛和马弓形虫感染进行的系统研究还很少，为摸清本地区三种动物弓形虫感染情况，我们对新疆部分地区的牛、牦牛和马进行随机抽样,应用T（R）-MT“荣研”日本试剂盒采用间接血凝实验(IHA)进行血清学调查。本实验对塔城沙湾县四道河子地区牛，阿勒泰地区的牛，104团乌拉斯台的牦牛和马进行检测,其感染率:塔城沙湾县区牛为53.85%(35/65), 阿勒泰地区牛为4324%(16/37), 104团乌拉斯台牦牛为40.00%（28/70）, 104团乌拉斯台马为5%（1/20），结果表明弓形虫在这三种动物中均有相当高的感染率,应引起人们的足够重视,加强防范。
关键词：新疆部分地区牛、牦牛和马；弓形虫病； 弓形虫病诊断试剂盒；间接血凝实验

前言
弓形虫病(又名弓形体病或弓浆虫病)是一种人兽共患寄生性原虫病，在国内最早由于恩庶（1955年）在猫、兔体内检获虫体[1]，谢天华（1964年）在江西报道了人体内病例。1977年上海农科院报道了猪的群发病例[2]。目前已知二百多种动物可受感染，在肉用畜禽中，猪牛、羊、鸡均可感染。弓形虫病不仅对人类造成严重危害，也对畜牧业的发展造成很大的影响。
弓形虫病的病原 [10] 存在形式包括以下几种形式: 速殖子、包囊、裂殖体、配子体、卵囊。速殖子呈弓形、月牙形或香蕉形，一端尖，一端钝，大小为1～7um×2～4um，主要见于急性病例；包囊也称组织囊，见于慢性病例的多种组织，呈圆形，有较厚的囊膜，直径50～69um，可在感染动物体内长期存在。囊内虫体称慢殖子，包囊形成是机体免疫力作用虫体的结果，若免疫力消失，慢殖子从包囊中释放出来，可以侵入新的细胞，再度引起发病；速殖子、包囊可出现于中间宿主的多种细胞中。裂殖体呈圆形，游离的裂殖子大小为7～10um×2.5～3.5um,前端尖，后端钝圆；配子体见于终末宿主,大小配子结合形成合子，合子形成卵囊；卵囊呈球形，孢子化后为亚球形，大小11～14um×9～11um。裂殖体和有性生殖阶段虫体可出现于猫和其他猫科动物小肠绒毛上皮细胞内。
弓形虫生活史可分为肠内阶段和肠外阶段。肠内阶段只出现于终末宿主体内，肠外阶段可出现于终末宿主和中间宿主体内。其中，中间宿主的种类很多，已报到的有200多种，包括肉食兽、食虫动物、啮齿动物、猪、草食兽、灵长类、人、其他哺乳动物和鸟类。终末宿主为食肉动物，已证明的有猫和其他一些猫科动物。中间宿主通过摄入被弓形虫卵囊污染的食物或饮水或通过摄食含包囊或速殖（滋养体）的其它动物而感染。猫（以及其他猫科动物）是终末宿主，在弓形虫传播中起重要作用。包囊主要存在于被感染动物的组织中，内有以缓慢方式进行增殖的缓殖子。被摄入的卵囊或缓殖子一旦进入肠道，子孢子或缓殖子进入快速增殖阶段——速殖子阶段。速殖子在肠道的固有层增殖，并最终传播到全身，速殖子可引起全身组织损伤，并最终发育为缓殖子、形成包囊。如果宿主在怀孕期间被感染，母体血液中的速殖子可通过胎盘进入胎儿。
目前，新疆对牛、牦牛和马的弓形虫感染进行系统研究很少，为摸清本地区家畜弓形虫感染情况，我们对塔城沙湾县四道河子地区牛、阿勒泰地区的牛、104团乌拉斯台的牦牛和马进行弓形虫感染的抽样调查，由于毕业实习时间比较短,收集血清工作比较繁琐及试验条件的限制等原因，本次试验我们应用T（R）-MT“荣研”日本试剂盒采用间接血凝试验（IHA）对采样进行弓形虫感染的血清学调查。
本人结合毕业进行了本次试验研究，现将应用T（R）-MT“荣研”日本试剂盒检测新疆牛，牦牛和马自然感染弓形虫的血清结果报告如下。
1 实验材料与方法
1.1 供试三种动物（牛、牦牛、马）血清
按随机抽样方法，2006年3～5月分批抽取了塔城沙湾县四道河子地区65头牛血，阿勒泰地区37头牛血，104团乌拉斯台地区70头牦牛血和20头马血作为调查标本，对所有血液进行血清分离。所有待检血清均保存于-25℃冰箱中。
1.2 诊断试剂
T（RMT“荣研”日本试剂盒内匹配的弓形虫诊断用缓冲液（规格：50ml/瓶），凝集乳液（规格：12ml/瓶），均是日本荣研化学株式会社生产的动物用医药品。本诊断用试剂盒由日本与动医学院合作课题经费所购买，由日方提供。以上试剂于2～10℃冰箱中冷藏保存。
1.3 实验仪器
96孔"V"型一次性血凝板；微量移液器枪头、枪头盒,以上仪器购自新疆化玻公司；200ul、100ul、20ul微量移液器、标号笔等,由指导老师提供。
1.4 检测方法
本次试验的方法原理是弓形虫的微量间接血凝实验（IHA）。其步骤如图1-1所示:
图1-1 弓形虫正向间接凝集实验术式表及步骤流程图
孔号 1 2 3 4 5 6
最终血清稀释度 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256
缓冲液(ul) 43.7 25 25 25 25 25
被检血清（ul） 6.3 25 25 25 25 25 弃25
抗原（ul） -- -- 25 25 25 25

将反应板置于桌面上水平震荡，充分混合

盖上一块与反应板大小相等的玻璃板以防灰尘落入，室温下静置一夜（12～24h）

判定

图1-2判定标准参考图
判定标准
判定标准以抗体滴度<1:32为阴性；=1:32为疑阳性；〉=1:64为阳性。如图1-2所示。
3：孔底有抗原抗体较大的凝集块，但周围凝集不规则。
2：孔底有抗原抗体较大的凝集块，且凝集均匀。
1：凝集团块中等大小 。
0．5：标准阴性对照。
0：孔底有非常明显的小的圆形沉淀物 。

2 实验结果
2.1 新疆三种动物弓形体感染调查结果
塔城沙湾县四道河子地区检查牛65头，检出阳性35头，感染率为53.85%；阿勒泰地区检查牛37头，检出阳性16头，感染率为43.24%，104团乌拉斯台检查牦牛70头，检出阳性28头，感染率为40%，104团乌拉斯台检查马20头，检出阳性1头，感染率为5%。抽样调查各畜类的阳性率详见表2-1。
2-1 新疆三种畜类弓形体感染调查结果
家畜
调查地区
检测头数
阳性数
阳性率
牛
塔城沙湾县四道河子地区
65
35
53.85%
阿勒泰地区
37
16
43.24%
牦牛
104团乌拉斯台
70
28
40.00%
马
104团乌拉斯台
20
1
5%
合计
三个地区
192
80
41.67%

2.2 不同地理条件阳性分布情况 下图所示，对塔城沙湾县四道河子地区检查牛的阳性率和阿勒泰地区检查牛的阳性率相比较，塔城沙湾县四道河子地感染率高于10%。104团乌拉斯台检查牦牛感染率较高，而104团乌拉斯台马的感染率较底。

2.3 三种不同动物阳性率对比 三种家畜中弓形体感染率最高是牛，如45%，第二个是牦牛为40%，最底的是马，其感染率为5%。详见图表2-3。

3 分析与讨论
3.1 通过对表2-1的统计分析，笔者发现塔城沙湾县四道河子地区以及阿勒泰地区牛弓形虫平均感染率为45% ，104团乌拉斯台的牦牛弓形虫平均感染率为40%，104团乌拉斯台的马弓形虫平均感染率为5%。我国对牛的弓形虫检测阳性率为黄牛为11.29%、水牛8.56%、奶牛23.12%。张德林等对天祝县牦牛检测的阳性率高达67.4%[4]；王虎、韩秀敏等青海省弓形虫病的研究指出青海省门源县牦牛感染率高达71.43%和59.31%[5]；叶玉美、魏德琼等对云南省弓形虫感染调查结果为牛的感染率分别为8.4%和6.2%[6]；摧君兆（执笔）的对14个省（市）34种蓄、禽弓形体病调查为新疆马的感染率为7.43%[7]。与上述结果相比，笔者发现本次调查的牛、牦牛和马的阳性率属于中间范围。但结果表明弓形虫病在新疆某些地区的不同家畜中呈现一定的流行趋势，应引起有关部门的重视。
3.2 由于抽检的样品中，不同地理条件弓形体的感染率不同,对塔城沙湾县四道河子地区检查牛的阳性率高于阿勒泰地区（约10%），104团乌拉斯台牦牛感染率较高，而104团乌拉斯台马的感染率较底，如图2-2 所示。所以笔者推测弓形虫的感染应当与地理条件有关系；在对农户的饲养管理条件的观察中发现，个别农户家圈舍的卫生条件较差,饲料保存不当,仓库简易,致使不少老鼠光顾和猫的经常光临,导致有弓形虫卵囊的粪便污染环境、饲料及饮水,当家畜食用后造成感染。老鼠在农户家里普便存在,是弓形虫常见的中间宿主,猫是弓形虫唯一的终末宿主, 两者在弓形虫传播中均起重要作用。因此,农户家内应尽量不养猫或对猫严格管理,禁止其四处乱跑,并注意加强灭鼠,以减少家畜对弓形虫的感染。通过分析发现, 饲养管理条件好的感染率低，饲养管理条件差的感染率较高，因此笔者有理由推测家畜弓形虫的感染与环境因素影响关系比较大。
3.3 许多动物对弓形虫都有一定的免疫力，故感染后多不表现临床症状，在组织内形成包囊后转为隐性感染。包囊是弓形虫在中间宿主体内的最终形式，可存活数月甚至终生。故某些场内家畜弓形虫感染的阳性率虽然高，但急性发病却很少。所以说,尽管牛场及农户家的牛，牦牛和马并没有弓形虫病史，仍然不可忽视对该病的防治工作。
3.4 本实验调查牛，牦牛和马弓形虫感染率采用的的是T（R）-MT“荣研”日本试剂盒，该试剂盒为商品化动物专用试剂盒，在亚太地区许多发达国家和发展中国家被广泛应用,并经反复实验验证，特异性好，检出率高。本实验严格按照操作说明书进行，按照既定判断标准进行判定。
3.5 目前对弓形虫感染的实验室检查可以采用血清学、病原学、分子生物学等方法。病原学方法虽较为简单，但敏感性差、耗时太长、容易漏诊；以PCR为代表的分子生物学诊断方法已广泛应用于寄生虫DNA的检测，其结果虽然检出结果准确，外界因素影响小，非特异性反应较少，比较适合弓形虫的检测，但是由于成本比较高，现在在基层难以推广。血清学检测，即一般采用直接凝集实验(DHT)、 间接血凝试验（IHA酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法检测弓形虫抗原或循环抗原。IHA已有商品化的诊断试剂盒,对仪器的要求不如ELISA那么复杂、精密,比较起来更为简单、易行,而且结果也比较可靠,所以本次实验便选择了此种方法。
3.6 新疆是少数民族聚居的地区，广大农牧民有喜食烤肉的风俗，但是在烤肉的加工过程中原始的加工方法不易杀死弓形虫的包囊和速殖子等感染原，这样一来，人们很容易在食用不完全烤熟的肉类以及内脏时感染弓形虫；而且怀孕女性更易感染，怀孕期间被感染，母体血液中的速殖子可通过胎盘进入胎儿，所以有许多少数民族妇女生下先天有缺陷，智力障碍的孩子的临床报道，严重者甚至发生流产[9]。所以应加强对家畜弓形虫的检测，以便早期发现流行态势并进行控制，不仅可以减轻畜牧养殖业的经济损失，而且对于维护人们的健康有着极其重大的意义。
3.7 笔者认为广大养殖户应当做好弓形虫病的预防工作，建议预防措施有如下几条：①圈舍保持清洁，定期消毒；②加强猫的饲养管理，防止猫及其排泄物污染畜舍，饲料，饮水；③消灭老鼠；④家畜流产的胎儿及其排泄物，以及死于本病的可疑病尸应严格处理等。弓形虫病的根本防制手段是研制行之有效使用方便的疫苗，但弓形虫生活史复杂，感染途径多，且可形成包囊逃避宿主的免疫攻击，因此研制弓形虫疫苗较为困难。现阶段还没有较完善的商品化的弓形虫疫苗可供使用，一切还处于研究阶段。
4 结论
4.1 经本试验研究，了解到在试验区牛、牦牛、马等三种动均不同程度感染弓形虫病，其感染率: 塔城沙湾县区牛为53.85%(35/65), 阿勒泰地区牛为43.24(16/37), 104团乌拉斯台牦牛为40.00%,104团乌拉斯台马为5%，这三种动物中相当高的感染率应引起人们的足够重视，加强防范。
4.2 本实验首次采用专门用于检测动物弓形虫感染的商品化试剂盒(日本制造)对新疆牛、牦牛和马进行弓形虫的血清学调查,通过试验表明，该试剂盒拥有反应灵敏、快捷、检出率高的特点，和部分专家采用间接血凝实验对国内其他地区的家畜进行的血清学调查相比, 此方法调查得动物的弓形虫发病率与国内其他专家的调查结果[4]基本相符。

谢 辞
在写作这篇论文的过程中，我阅读了大量资料，包括图书馆藏书，各种相关期刊、杂志和学报，还在上网搜索了许多相关信息与材料。在此，对引用的资料的出版社及原作者表示感谢。
这篇论文的顺利完成也得到了我的实习单位新疆农业大学动医学院（寄生虫教研室）的吾其尔，巴音查汗等老师的大力支持，他们为我采样和做实验提供各种便利条件。最重要的是我的指导教师吾其尔、巴音查汗老师对论文的写作做了及时而恰当的指导，并提出了许多宝贵的建议和修改意见，他们多次帮助我修改论文,才使这篇论文去粗取精,布局也更合理,更严谨,再次向他们表示最诚挚的谢意！
最后感谢所有在我完成论文过程中提供帮助的老师,同学和朋友们。还要感谢我的家人,是他们四年来支持我完成学业,给予我现今的一切.

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新疆农业大学
毕业论文

课 题:
应用弓形虫病诊断试剂盒对新疆部分地区牛、牦牛和马弓形虫感染的血清学调查
姓 名:
热孜万古丽.阿布都拉
学 院:
动物医学学院
专 业:
临床医学
班 级:
015班
学 号:
013631541
指导教师:

吾其尔、巴音查汗 职称: 副教授

2006年6月14日

目 录
摘要…………………………………………………………………………………1
关键词………………………………………………………………………………1
前言……………………………………………………………………………2
1 实验材料与方法……………………………………………………………2
1.1供试三种动物（牛、牦牛、马）血清……………………………………………2
1.2诊断试剂…………………………………………………………………2
1.3实验仪器…………………………………………………………………3
1.4 检测方法…………………………………………………………………3
2 实验结果………………………………………………………………………4
3 分析与讨论……………………………………………………………………5
4 结论……………………………………………………………………………6
谢辞………………………………………………………………………………7
参考文献…………………………………………………………………………8
１０