1、中华鳖脾脏cDNA文库构建及其CD3γ/δ，CD3ζ分子的克隆
中华鳖是我国一种珍贵的、经济价值很高的水生动物。全国各地已经广泛开展其人工养殖，然而，在水体中还存在很多危害中华鳖的致病菌，对水产养殖构成巨大威害。另外，我们对于爬行动物免疫分子的认识处于初级阶段，是在所有脊椎动物类群研究中了解最少的。然而爬行动物处于动物从水生到陆生的重要阶段，因而在进化上具有重要的意义。但是国内外对中华鳖免疫系统与免疫反应规律的研究甚少，因此对中华鳖主要免疫基因组成和免疫应答规律的研究具有重要意义，并且这些研究成果将在中华鳖的健康养殖和病害防治等方面也具有一定的指导意义。
以细菌脂多糖刺激中华鳖的脾脏为
2、材料，应用clonminer的cDNA文库构建试剂盒（Invitrogen）构建了中华鳖脾脏的cDNA文库，文库滴度为1.73×106pfu/ml,含有1.38×107个重组子，重组率为91%，cDNA插入片段大小在0.3-2kb以上，平均插入片段大小为1.2kb。对文库中部分克隆EST测序，经NCBI数据库中进行比对，结果获得一些免疫相关的EST，如CD151，CD20，CD3γ/δ，CD46，β2微球蛋白，补体调节蛋白，C型凝集素，B-型凝集素，免疫球蛋白J链，免疫球蛋白λ链，免疫球蛋白μ链结合蛋白，Fc受体，胸腺素，Fc受体等，为进一步研究爬行动物分子免疫奠定一定的基础。
CD3分子是
3、T总淋巴细胞的标记分子，它以TCR-CD3复合物的形式存在，TCR识别抗原后，CD3分子中的ITAM将其T细胞活化信号传递到胞内。本研究通过构建中华鳖脾脏cDNA文库获得部分EST序列，通过RACE方法扩增出CD3γ/δ链全长cDNA。其cDNA全长为971nt，包含5′非编码区134nt，3′非编码区324 nt，开放阅读框513 nt，编码170个氨基酸。其预测的氨基酸序列包括22个氨基酸组成的信号肽，胞外区，跨膜区，以及胞浆区，胞外区含有保守的CXXC结构域，胞浆区含有一个保守的ITAM结构域。应用生物软件对中华鳖CD3γ/δ氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列进行同源性分析，结果显示中华鳖
4、γ/δ和鸡的γ/δ相似性最高，达到59%。将其胞外部分构建原核表达载体pET32a-CD3，重组蛋白在大肠杆菌内以包涵体的形式表达。通过同源序列分比较析并设计兼并引物，用PCR和RACE PCR的方法获取到CD3ζ链的cDNA序列。其cDNA全长为1460nt，包含5′非编码区24nt，3′非编码区929 nt，开放阅读框507 nt，编码168个氨基酸。其预测的氨基酸序列包括信号肽，由10 个氨基酸组成的胞外区，跨膜区，以及胞浆区，而且胞浆区含有三个保守的ITAM结构域。应用生物软件对中华鳖CD3ζ氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列进行同源性分析，结果显示中华鳖CD3ζ和鸡的CD3ζ相似性最高
5、达到86%，其次为人（77%），大鼠（74%），小鼠（74%），非洲爪蟾（64%）。对CD3γ/δ，CD3ζ的系统进化树分析，结果均显示爬行类的CD3分子跟鸟类的CD3分子聚为一枝，进化关系最近。
实验后期工作一方面通过同源克隆中华鳖CD3ε，CD4，CD8 T细胞表面标记分子，并研究其表达规律；另一方面将制备CD3单克隆抗体，分离出T细胞，为以后的功能研究奠定基础。
关键词：中华鳖；脾脏；cDNA文库；CD3γ/δ；CD3ζ
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