EB病毒检测技术进展及临床应用ppt课件.ppt

EB病毒检测技术及临床应用病毒检测技术及临床应用概述概述Epstein-BarrEpstein-Barr病毒（病毒（EBVEBV）疱疹病毒科，疱疹病毒科，亚科，嗜淋巴细胞病毒属，亚科，嗜淋巴细胞病毒属，19641964年由年由EpsteinEpstein、BarrBarr等人首次在非洲儿童的恶性淋巴瘤组织培等人首次在非洲儿童的恶性淋巴瘤组织培养中发现。养中发现。EBVEBV是是传染性单核细胞增多症的病原体，也是一种重要的肿瘤相是是传染性单核细胞增多症的病原体，也是一种重要的肿瘤相关病毒，与鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌、移植后淋巴增殖症等多种肿关病毒，与鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌、移植后淋巴增殖症等多种肿瘤的发生密切相关，被列为致癌性病毒之一。瘤的发生密切相关，被列为致癌性病毒之一。概述概述传播途径：传播途径：EBVEBV感染感染主要主要通过唾液接触传播通过唾液接触传播，也可通过，也可通过血液传播；血液传播；人感染人感染EBVEBV后建立终身潜伏感染，人群感染率超过后建立终身潜伏感染，人群感染率超过90%90%。1-61-6岁岁儿儿童童、14-2014-20岁岁青青少少年年及及年年轻轻成成年年人人高高度度易易感感，发发展中国家展中国家EBVEBV感染多发生在儿童早期感染多发生在儿童早期。病原学病原学n疱疹病毒科，疱疹病毒科，疱疹病毒亚科，淋疱疹病毒亚科，淋巴隐病毒属，人疱疹病毒巴隐病毒属，人疱疹病毒4 4型型n球形球形双链双链DNADNA病毒病毒，基因组，基因组平均大平均大小约为小约为172 kb172 kbEBV致病机制致病机制原发原发EBV感染时，感染时，EBV先是在先是在口咽部上皮细胞内增殖口咽部上皮细胞内增殖，然后感染附近的然后感染附近的B淋巴细胞淋巴细胞，受到感染的，受到感染的B淋巴细胞进淋巴细胞进入血液循环可以造成全身性感染。入血液循环可以造成全身性感染。EBV原发感染后，大多数无临床症状，尤其是原发感染后，大多数无临床症状，尤其是6岁以岁以下幼儿大多表现为隐性或轻型发病，但在儿童期、青下幼儿大多表现为隐性或轻型发病，但在儿童期、青春期和青年期春期和青年期，约，约50%的原发性感染均表现为的原发性感染均表现为IM。EBV在人体在人体B细胞建立潜伏感染，细胞建立潜伏感染，EBV只表达潜伏抗原只表达潜伏抗原（包括（包括EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-LP、LMP-1、LMP-2及及EBER），受），受感染者将成为终身带毒者。感染者将成为终身带毒者。在机体免疫功能下降和某些因素触发下，潜伏的在机体免疫功能下降和某些因素触发下，潜伏的EBV可以可以被再激活，引起病毒复制及临床疾病。被再激活，引起病毒复制及临床疾病。EBV致病机制致病机制EBV常见相关疾病常见相关疾病传染性单核细胞增多症传染性单核细胞增多症 （Infectious mononucleosis,IM)Infectious mononucleosis,IM)慢性活动性慢性活动性EBEB病毒感染病毒感染 （Chronic active EBVinfectionChronic active EBVinfection，CAEBVCAEBV）EBEB病毒相关性嗜血细胞综合征病毒相关性嗜血细胞综合征 （EBV-associated hemophagocytic syndrome,EBVAHS)EBV-associated hemophagocytic syndrome,EBVAHS)BurkittsBurkitts淋巴瘤淋巴瘤 何奇金淋巴瘤何奇金淋巴瘤EBVEBV感染的抗原表达感染的抗原表达n nEBVEBVEBVEBV溶解性感染期溶解性感染期溶解性感染期溶解性感染期，可可可可表达：表达：表达：表达：qq早期抗原（早期抗原（早期抗原（早期抗原（EAEAEAEA）：）：）：）：n nEA/REA/REA/REA/R和和和和EA/DEA/DEA/DEA/D（具（具（具（具DNADNADNADNA多聚酶活性）；多聚酶活性）；多聚酶活性）；多聚酶活性）；n n EAEAEAEA出现表明出现表明出现表明出现表明EBVEBVEBVEBV活跃增殖，活跃增殖，活跃增殖，活跃增殖，EAEAEAEA抗体出现在感染早期抗体出现在感染早期抗体出现在感染早期抗体出现在感染早期；qq衣壳蛋白（衣壳蛋白（衣壳蛋白（衣壳蛋白（VCAVCAVCAVCA）n n晚期表达的结构蛋白晚期表达的结构蛋白晚期表达的结构蛋白晚期表达的结构蛋白n nVCA-IgMVCA-IgMVCA-IgMVCA-IgM出现在急性感染早期，出现在急性感染早期，出现在急性感染早期，出现在急性感染早期，VCA-IgGVCA-IgGVCA-IgGVCA-IgG出现在急性感染期并持出现在急性感染期并持出现在急性感染期并持出现在急性感染期并持续存在续存在续存在续存在qq膜抗原（膜抗原（膜抗原（膜抗原（MAMAMAMA）：）：）：）：n n细胞表面包膜糖蛋白（细胞表面包膜糖蛋白（细胞表面包膜糖蛋白（细胞表面包膜糖蛋白（MA gp350/220,gp85)MA gp350/220,gp85)MA gp350/220,gp85)MA gp350/220,gp85)，是是EBVEBV的中和性抗的中和性抗原原n n抗抗抗抗MA-IgMMA-IgMMA-IgMMA-IgM可用于早期诊断可用于早期诊断可用于早期诊断可用于早期诊断n nEBVEBVEBVEBV潜伏感染期，潜伏感染期，潜伏感染期，潜伏感染期，选择性表达早期抗原以及选择性表达早期抗原以及选择性表达早期抗原以及选择性表达早期抗原以及：qq 核抗原（核抗原（核抗原（核抗原（EBNA-1,-2,-LP,-3A,-3B,-3CEBNA-1,-2,-LP,-3A,-3B,-3CEBNA-1,-2,-LP,-3A,-3B,-3CEBNA-1,-2,-LP,-3A,-3B,-3C）：）：）：）：n n为为为为DNADNADNADNA结合蛋白，在感染的结合蛋白，在感染的结合蛋白，在感染的结合蛋白，在感染的B B B B细胞核内；细胞核内；细胞核内；细胞核内；n nEBNA-1EBNA-1EBNA-1EBNA-1与感染有关，与感染有关，与感染有关，与感染有关，EBNA-2EBNA-2EBNA-2EBNA-2与细胞转化和永生化有关；与细胞转化和永生化有关；与细胞转化和永生化有关；与细胞转化和永生化有关；n nEBNAEBNAEBNAEBNA抗体出现在感染晚期。抗体出现在感染晚期。抗体出现在感染晚期。抗体出现在感染晚期。qq 潜伏膜蛋白潜伏膜蛋白潜伏膜蛋白潜伏膜蛋白（LMP-1,-2A,-2BLMP-1,-2A,-2BLMP-1,-2A,-2BLMP-1,-2A,-2B）：）：）：）：n n在感染在感染在感染在感染B B B B细胞表面，与细胞恶化有关，细胞表面，与细胞恶化有关，细胞表面，与细胞恶化有关，细胞表面，与细胞恶化有关，qq 未翻译的转录物未翻译的转录物未翻译的转录物未翻译的转录物BARF0BARF0BARF0BARF0和和和和EBEREBEREBEREBERqq EBNA-3EBNA-3EBNA-3EBNA-3、EBNA-2EBNA-2EBNA-2EBNA-2、LMP-1LMP-1LMP-1LMP-1是是是是EBV-CTL CD8+EBV-CTL CD8+EBV-CTL CD8+EBV-CTL CD8+的主要目标的主要目标的主要目标的主要目标EBVEBV感染的抗原表达感染的抗原表达原发性原发性EBVEBV感染过程中首先产生针对感染过程中首先产生针对衣壳抗原（衣壳抗原（capsid antigen,capsid antigen,VCAVCA）IgGIgG和和IgMIgM，在急性感染的晚，在急性感染的晚期，抗早期抗原（期，抗早期抗原（early antigen,early antigen,EAEA）抗体出现在恢复期晚期，抗核）抗体出现在恢复期晚期，抗核抗原（抗原（nuclear antigen,NAnuclear antigen,NA）抗体产）抗体产生，生，抗抗VCA-IgGVCA-IgG和抗和抗NA-IgGNA-IgG可持续终身可持续终身EBV感染的血清学诊断传统检测策略的问题5%新近新近EBV感染不出现感染不出现CA-IgM抗体抗体在罕见的病例中抗CA-IgM会持续存在约20-30%的新近感染不出现EA-IgG抗体抗EBNA-IgG抗体可能呈现阴性，由于：-慢性活动性EBV感染-细胞免疫被抑制EBVEBV感染的血清学诊断感染的血清学诊断n抗抗VCA-IgMVCA-IgM和和IgGIgG可以同时出现，通可以同时出现，通常常IgGIgG出现较出现较IgMIgM晚，但偶尔较晚，但偶尔较IgMIgM出出现早现早1 12 2周，抗周，抗VCA-IgMVCA-IgM几周后检测几周后检测不到不到n抗抗EA-IgGEA-IgG在发病后在发病后3-43-4周后升高，周后升高，3 34 4月后检测不到月后检测不到n抗抗EBNA-1-IgGEBNA-1-IgG在发病后在发病后3 34 4周被检测周被检测到，持续终身，部分慢性到，持续终身，部分慢性EBVEBV感染者感染者检测不到检测不到n抗抗VCA-IgGVCA-IgG和抗和抗EBNA-1-IgGEBNA-1-IgG终生持续终生持续阳性阳性EBV常见相关疾病常见相关疾病传染性单核细胞增多症传染性单核细胞增多症(IM)(IM)infectious mononucleosis特指由特指由EBV感染引起的发热、咽炎和淋巴结肿大的综合征感染引起的发热、咽炎和淋巴结肿大的综合征1889年被首次描述为年被首次描述为“glandular fever”1920年正式定义为年正式定义为IM1932年发现嗜异性凝集实验年发现嗜异性凝集实验1968年实验室工作人员感染年实验室工作人员感染EBV，出现，出现IM临床症状和嗜临床症状和嗜异性凝集抗体，明确异性凝集抗体，明确EBV是是IM的病原的病原IMIM临床表现临床表现n25-30%25-30%的青少年和的青少年和3010102.52.5copies/copies/g g q原位杂交原位杂交：检测出：检测出EBER-1EBER-1阳性细胞阳性细胞qSouthernSouthern杂交杂交：受累组织或外周血中检测出：受累组织或外周血中检测出EBV DNAEBV DNAq免疫荧光免疫荧光：检测到抗原（：检测到抗原（EBNAEBNA、LMPLMP）q感染的感染的B B、T T、NKNK细胞、单核细胞、单核/巨噬巨噬/组织细胞组织细胞检测到检测到EBNAEBNA、EBEREBER、EBV-DNAEBV-DNAEBVEBV相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症EBV-associated hemophagocytic lymphohistocytosis EBV-HLH n是一种与是一种与EBVEBV感染有关的淋巴增殖伴随吞噬血细胞现象的一类疾病感染有关的淋巴增殖伴随吞噬血细胞现象的一类疾病nEBVEBV感染所致感染所致CD8+TCD8+T细胞的异常增殖及其激活巨噬细胞，导致炎症细胞细胞的异常增殖及其激活巨噬细胞，导致炎症细胞因子大量释放产生高细胞因子血症（细胞因子风暴）是因子大量释放产生高细胞因子血症（细胞因子风暴）是EBV-HLHEBV-HLH的主的主要病例生理特征要病例生理特征n临床表现发热、肝脾肿大、黄疸、全血细胞减少、临床表现发热、肝脾肿大、黄疸、全血细胞减少、DICDIC，骨髓和其他，骨髓和其他组织见嗜血细胞、组织见嗜血细胞、LDHLDH、铁蛋白、铁蛋白、微球蛋白微球蛋白nEBV-HLHEBV-HLH常见于儿童和青少年常见于儿童和青少年抗抗EBVEBV病毒药物病毒药物n无环核苷拟似剂无环核苷拟似剂qacyclovir（阿昔洛韦），（阿昔洛韦），ED50 0.3qganciclovir（更昔洛韦），（更昔洛韦），ED50 0.05qvalaciclovir（缬昔洛韦（缬昔洛韦）n无环核苷酸无环核苷酸qcidofovir，adefovirn焦磷酸盐焦磷酸盐 拟似剂拟似剂 qfoscarnet（磷甲酸钠）（磷甲酸钠）n作用机制作用机制q作用病毒作用病毒DNA多聚酶，抑制病毒复制多聚酶，抑制病毒复制EBVEBV感染的实验室诊断感染的实验室诊断n外周血分类外周血分类q淋巴细胞淋巴细胞50%WBC50%WBCq不典型淋巴细胞不典型淋巴细胞10%WBC10%WBC（系激活的（系激活的CD8+CTLCD8+CTL）n血清学检查血清学检查q嗜异性凝集实验（嗜异性凝集实验（heterophile test/spot testheterophile test/spot test）qVCA-IgMVCA-IgM、IgGIgG，EA-IgGEA-IgG，EBNA-IgGEBNA-IgGn病毒学标志病毒学标志q在在PBMCPBMC、血清、全血或感染组织检测、血清、全血或感染组织检测EBV-DNAEBV-DNA、EBEREBER、EBNAEBNA、LMPLMPEBVEBV感染疾病的血清学感染疾病的血清学诊诊断断诊诊断断VCA IgMVCA IgMVCA IgGVCA IgGEA IgGEA IgGEBNA IgGEBNA IgG既往无感染既往无感染IM(IM(急性期急性期)IMIM（恢复期）（恢复期）/既往感染既往感染低低/慢性活慢性活动动性感染性感染/高高高高/临床需要回答的问题临床需要回答的问题是否感染是否感染EBV?EBV?EBVEBV感染的时相？感染的时相？是否是否EBVEBV活动性感染？活动性感染？疾病是否与疾病是否与EBVEBV感染相关？感染相关？EBV实验室检测方法实验室检测方法 病毒培养病毒培养免疫学技术（免疫荧光法，免疫组化技术）免疫学技术（免疫荧光法，免疫组化技术）血清学方法（血清学方法（ELISA法，化学发光法）法，化学发光法）基因诊断技术基因诊断技术 嗜嗜异异凝凝集集抗抗体体试试验验：也也称称“Monospot”试试验验。在在EBV还还未未确定为确定为IM的病因之前，的病因之前，1932年引入临床实践诊断年引入临床实践诊断IM。当当时时发发现现IM患患者者的的血血清清或或血血浆浆可可以以凝凝集集马马或或绵绵羊羊的的红红细细胞胞。该抗体在病程第该抗体在病程第12周出现，持续约周出现，持续约6个月。个月。在在青青少少年年原原发发性性EBV感感染染中中其其阳阳性性率率可可达达80-90，约约10的青少年缺乏对嗜异性抗体的阳性反应。的青少年缺乏对嗜异性抗体的阳性反应。EBV实验室检测方法实验室检测方法EBVEBV感染的血清学诊断评价感染的血清学诊断评价n嗜异性抗体（嗜异性抗体（heterophile antibody，HA）凝集实验）凝集实验（“spot”test）q嗜异性抗体（嗜异性抗体（IgM）在发病后）在发病后7天内出现，天内出现，2-5周达高峰，可以持周达高峰，可以持续续6-12个月，偶有个月，偶有12个月后以低水平存在个月后以低水平存在qHA阳性提示原发急性感染，阳性提示原发急性感染，EBV再激活感染几乎阴性再激活感染几乎阴性q阳性率：青少年和成年人阳性率：青少年和成年人71%-90%，2-5岁儿童岁儿童50%q假阴性：发病第假阴性：发病第1周内假阴性率周内假阴性率25%，10%成人始终阴性成人始终阴性q假阳性：假阳性：2-3%自身免疫性疾病、自身免疫性疾病、HIV感染、心内膜炎、感染、心内膜炎、HAV肝炎肝炎v缺点缺点需要硬件设备需要硬件设备成本昂贵成本昂贵v优点优点敏感性高敏感性高特异性强特异性强操作简便操作简便化学发光技术化学发光技术胶体金是氯金酸HAuCl4的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态简便，快捷，敏感度和特异度较差EBERSEBERS原位杂交试验原位杂交试验 EBV EBV潜伏感染的细胞含有大量的潜伏感染的细胞含有大量的EBERlEBERlEBER2EBER2（EBERSEBERS）转录子，其主要功能是抑制干扰素介导）转录子，其主要功能是抑制干扰素介导的抗病毒效应和凋亡。该转录子不翻译成蛋白质，每个的抗病毒效应和凋亡。该转录子不翻译成蛋白质，每个EBVEBV潜伏感染的细胞含有大约潜伏感染的细胞含有大约10106 6拷贝拷贝EBERSEBERS，被认为，被认为EBVEBV潜伏感染的最好标志物，因此原位杂交检测肿瘤细胞中潜伏感染的最好标志物，因此原位杂交检测肿瘤细胞中EBERSEBERS是诊断肿瘤是否是诊断肿瘤是否EBVEBV相关的金标准相关的金标准EBV实验室检测方法实验室检测方法EBV病毒核酸检测病毒核酸检测实时荧光定量实时荧光定量PCR是目前最主要的监测是目前最主要的监测EBV载载量的方法量的方法鉴别鉴别EBV健康携带者的低水平复制与健康携带者的低水平复制与EBV相关相关疾病患者高水平活动性感染。疾病患者高水平活动性感染。EBV EBV载量检测有多种方法，载量检测有多种方法，Real-time PCRReal-time PCR是是目前最主要的监测目前最主要的监测EBVEBV载量的方法，有较强的敏载量的方法，有较强的敏感性和特异性。不同的感性和特异性。不同的EBVEBV疾病进行疾病进行Real-time Real-time PCRPCR检测时，需要的标本不同。检测时，需要的标本不同。EBV病毒核酸检测病毒核酸检测疾病疾病感染细胞感染细胞感染方式感染方式检测病毒定量的最合适标本检测病毒定量的最合适标本血浆血浆/血清血清单核细胞单核细胞全血全血传染性单核传染性单核细胞增多症细胞增多症（IMIM）B B细胞细胞浆细胞浆细胞溶解性感染溶解性感染潜伏潜伏理想理想不推荐不推荐不推荐不推荐移植后淋巴移植后淋巴增殖性疾病增殖性疾病（PTLDPTLD）B B细胞细胞潜伏潜伏理想理想最合适最合适慢性活动性慢性活动性EBVEBV感染感染（CAEBVCAEBV）T T细胞细胞NKNK细胞细胞潜伏潜伏评价预后评价预后适合诊断适合诊断EBV相关性疾病的病毒相关性疾病的病毒DNA定量检测定量检测血清游离的血清游离的EBV-DNA提示原发感染或者再激活提示原发感染或者再激活健康携带者血清健康携带者血清EBV-DNA通常检测不到通常检测不到传单的传单的EBV感染实验室诊断感染实验室诊断血清学检测：血清学检测：同时满足下列同时满足下列2条者可以诊断为条者可以诊断为EBV-IM:1.下列临床症状中的下列临床症状中的3项：发热、咽峡炎、颈淋巴结肿大、肝肿大、项：发热、咽峡炎、颈淋巴结肿大、肝肿大、脾肿大；脾肿大；2.原发性原发性EBV感染的血清学证据，满足下列感染的血清学证据，满足下列2条中任一项：条中任一项：（1）抗）抗EBV-CA-IgM和抗和抗EBV-CA-IgG阳性，且抗阳性，且抗EBV-NA-IgG阴性阴性（2）抗）抗EBV-CA-IgM阴性，但抗阴性，但抗EBV-CA-IgG阳性，且为低亲和力抗体阳性，且为低亲和力抗体传单的传单的EBV感染实验室诊断感染实验室诊断DNA检测？检测？:IM患者外周血中患者外周血中EB病毒载体在病毒载体在2周内达到峰值，随后周内达到峰值，随后很快下降。很快下降。至病程至病程14天，多数天，多数EBV-IM患者血清中已检测不到病毒患者血清中已检测不到病毒核酸，病程核酸，病程22天后，所有天后，所有EBV-IM患者血清中均检测不患者血清中均检测不到病毒核酸。到病毒核酸。IM患者不推荐进行患者不推荐进行EB病毒载量检测病毒载量检测慢性活动性慢性活动性EBV感染的实验室诊断感染的实验室诊断nEBV抗体检测抗体检测抗体反抗体反应应类类型型EBV抗体抗体比例（比例（%）CA-IgGCA-IgMEA-IgGNA-IgG1+-+54.92+-+-25.53+5.94+-5.95+-+3.96+-3.9慢性活动性慢性活动性EBV感染的实验室诊断感染的实验室诊断DNA检测检测绝大多数绝大多数CAEBV患者患者PBMC中中EBV-DNA水平高于水平高于102.5拷贝拷贝/ug DNA部分部分CAEBV患者血浆患者血浆/血清中血清中EBV-DNA阴性阴性CAEBV患者血浆患者血浆/血清中血清中EBV-DNA水平与病情严重程度和预水平与病情严重程度和预后有关后有关EB病毒相关噬血淋巴组织细胞增生症病毒相关噬血淋巴组织细胞增生症nEBV-HLH可以发生在原发性可以发生在原发性EBV感染时期，既往感染时期，既往EBV感染再激活时期感染再激活时期nEBV-HLH患者血清中患者血清中EBV抗体反应呈多种反应类型，抗体反应呈多种反应类型，n单纯血清单纯血清EBV抗体检测对抗体检测对EBV-HLH的诊断意义不大。的诊断意义不大。感染感染类类型型EBV抗体抗体比例（比例（%）CA-IgGCa-IgMEA-IgGNA-IgG再次激活再次激活+-+30.8+-+21.8+17.9原原发发感染感染+-16.7+-12.8总总阳性率阳性率（%）10047.448.770.5EB病毒相关噬血淋巴组织细胞增生症病毒相关噬血淋巴组织细胞增生症DNA检测检测:nEBV-HLH患者外周血单个核细胞和血浆患者外周血单个核细胞和血浆/血清均含有血清均含有很高的很高的EBV-DNA载量，结合血清学抗体检测，有助载量，结合血清学抗体检测，有助于于EBV-HLH的诊断。的诊断。n监测监测EBV-HLH患者血清中患者血清中EBV-DNA载量有助于评估载量有助于评估治疗效果。治疗效果。小小 结结 EB EB病毒感染率高病毒感染率高,传播范围广传播范围广,且多为隐性感染且多为隐性感染,临临床症状多种多样床症状多种多样,临床诊断和治疗较为复杂，临床诊断和治疗较为复杂，EBEB病毒病毒实验室检测在临床诊断中具有重要意义，根据临床需实验室检测在临床诊断中具有重要意义，根据临床需要进行合理分析，选择方便、实用、高效的检测方法，要进行合理分析，选择方便、实用、高效的检测方法，为临床治疗提供依据。为临床治疗提供依据。Thank you 谢谢 谢谢