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检测自身免疫抗体的蛋白质芯片技术

磁性微粒的扫描电子显微照片，由Bio-Rad Laboratories公司(美国加州，Hercules)的BioPlex 2200免疫测定系统（该设备具多路复用测定功能）采用。
自身免疫性疾病是由异常免疫反应引起的慢性退行性或炎症性疾病。不同的自身免疫性疾病对机体的影响各有不同。例如，在多发性硬化症中，自身免疫反应的侵害对象是中枢神经系统，而在克罗恩病中则是肠道。此外，同种疾病对不同个体的组织和器官的影响程度不尽相同。
此类疾病的严重程度取决于患者的免疫系统情况。其人群患病率在3%以上，女性和老年人居多。炎症是许多此类疾病的常见症状，其他症状包括：眩晕、疲劳、不适及低烧。器官特异性自身免疫性疾病可侵害靶器官或组织，导致功能受损。
对此类疾病的诊断相当困难，尤其是在发病初期。对健康个体进行的特异性自身抗体检测表明：不同疾病的阳性结果发生率少则接近0%，多则超过10%。健康个体中的大多数抗体的滴定浓度都很低，对健康没有不良影响。
自身抗体并不总是针对某种风湿性疾病。例如，与天然双链DNA (dsDNA) 发生反应的抗体通常对系统性红斑狼疮(SLE)具有诊断意义。但是，抗双链DNA抗体也可见于患有其他疾病的个体中，如风湿性关节炎、干燥综合症、硬皮病、药物性狼疮、慢性活动性肝炎、格雷夫斯氏病及其他疾病。抗双链DNA抗体在上述疾病的患者中发生率一般低于5%。因此抗双链DNA抗体对SLE没有诊断意义。
在少数情况下，自身抗体具有很强的疾病特异性。目前已鉴别出一些常见风湿性疾病的自身抗体靶点（表I）。
本文就自身抗体检测技术进行了回顾性评述，开篇先介绍一些成熟的检测方法，最后则展望未来的发展趋势。多路复用蛋白质分析技术是讨论的核心焦点。本文还研究了各种多路复用自身免疫测定法，并阐述了开发人员所面临的困难。
目前的检测方法
检测自身免疫相关抗体的第一种方法是琼脂凝胶平板双向扩散法，但是这种方法早已被更快速、更灵敏的半定量方法所取代。
检测血清中自身抗体的常用实验室试验：免疫测定（通常为酶免疫测定）、间接免疫荧光显微技术 (IFA)、免疫印迹及免疫沉淀。上述试验中只有第一种是半定量试验；其他均为定性试验。通过IFA法进行筛查需要耗费大量的人力，而且要求训练有素的技术人员对显微镜染色图谱进行目测解读。这种方法缺乏可靠的标准，其结果取决于观察者的技能。IFA阳性结果并不能确定抗原的存在。因此，在提出具体治疗方案的建议方面，其作用十分有限。
疾病
最常见的抗原
系统性红斑狼疮
双链DNA、Sm抗原、抗核抗原
干燥综合症
干燥综合症A抗原 (52和60 kDa)和B抗原 (SSA和SSB)、抗核抗原
系统性硬化症
拓扑异构酶I、着丝粒蛋白B、抗核抗原
类风湿性关节炎
类风湿因子、环瓜氨酸肽

格雷夫斯氏病
促甲状腺激素受体
原发性胆汁性肝硬化
线粒体蛋白
重症肌无力
乙酰胆碱受体
慢性特发性血小板减少性紫癜
血小板抗原
1型糖尿病
胰岛β-细胞抗原
表I. 针对某些主要风湿性疾病最常用的自身免疫分析技术。
这些方法的最大缺陷是每次分析只能获得一个结果。通常，为了获得完整的自身抗体检测结果，需要进行多次试验。
长期以来，研究人员希望能够同时检测同一类别的多种分析物，如自身抗体、过敏原及甲状腺功能试验，而多路复用技术的出现使这一目标得以实现。采用多路复用分析技术时，一份样品可以在同一个反应器中产生多个报告结果。多路复用技术非常适用于多因素疾病的诊断，这种疾病需要进行多种实验室检测方能做出诊断。以复合模式（多路复用技术）对合理设定的多种分析物进行分析具有许多优点：
· 节约试剂、实验室耗材以及劳动力成本，特别是劳动力成本。
· 通过病人的少量标本即可获得大量信息，这一点对于儿科尤为重要。
· 能够同时检测核酸、抗原、抗体及药物等多种分析物。
· 具有内部质量控制功能，确保试验结果的准确性。
· 样品处理量增大。
· 能够鉴别分析物浓度的图谱。
另外，多路复用技术适应了当今工业和市场的发展趋势，即：劳动力短缺、自动化程度提高、过程标准化以及实验室联合。
芯片技术
多路复用蛋白质分析技术最近研制成功，主要包括两种子技术：平板芯片和球形芯片。

图1. 某试验中所用的二维芯片的布局示意图，该芯片内含14种自身抗原(A–N)、阳性(+)和阴性(–)对照以及IgG校准品，不同位置上校准品的浓度以两倍的速度从1 mg/ml (C1)递增至16 mg/ml (C5)。
平板芯片：该技术采用一块二维微芯片，芯片内含针对各种分析所定义的反应位点。通过可溶阶段的配合基，平板芯片可以对蛋白质、代谢物及其他分子组成的混合物中的几种固定化蛋白进行同时检测。
几年前，某研究小组制造了一种内置1152个反应位点的自身抗原芯片。这种平板芯片采用聚左旋赖氨酸包被的玻璃载玻片作为固体载体。将196种不同的假定自身抗原以4个或8个复制组的形式进行点样，由此产生有序阵列。结合在固体基质上的蛋白质包括36种重组或纯化蛋白质、6种核酸抗原以及154种重叠和免疫显性合成肽，这些肽来自于核内小分子核糖核蛋白、Sm抗原蛋白、多聚（二磷酸腺苷-核糖）聚合酶以及H1、H2A、H3和H4组蛋白。在芯片内可进行针对磷酸化激活修饰蛋白的抗体试验。通常以荧光素Cy3标记的羊抗人IgG作为芯片试验的标记物。
试验可以检测出纳克/毫升浓度水平的抗体，而且线性范围达三个对数。分析灵敏度一般高于酶联免疫吸附分析法(ELISA)。
此项研究所暴露出的一个技术问题是，几种Sm抗原和组蛋白因点样技术被灭活了。据推测，蛋白与固体表面的结合是抗原表位丢失的原因。研究人员表示，或许可以通过优化结合化学性质或者改进表面包被技术来纠正这一问题。此外，一些结合在载玻片上的抗原还受到蒸发速度过快的不利影响。
另一组研究人员也进行了一项试验，他们把14种自身抗原复本以及空白对照和校准品点样在聚苯乙烯孔中（图1），然后将辣根过氧化物酶标记的抗人IgG与可激活的化学发光底物同时使用，并且通过以电荷耦合器件（CCD）摄像机为基础的芯片检测仪记录到了光信号。通过人IgG校准品进行抗体定量。该技术将最常用的临床试验整合在一块简单的微型芯片上。就分析结果而言，这种塑料芯片与商用分析试剂盒不相上下。
作为临床试验室和生物医学研究的专用自动化平台，Randox Evidence采用了蛋白质生物芯片技术，通过CCD摄像机对化学发光反应产生的发射光进行探测。

图2. Luminex系统中5 x 5红色/橙色25球芯片的小球分布图。在这张液相球形芯片分布图上，每个小球装置带有不同含量的红光和/或红外线荧光染料，以此对具有各种不同荧光特征的小球进行区分。
球形芯片：多路复用蛋白质分析技术的第二种子技术采用了一种微球装置悬浮液，每个装置代表了一种不同的分析试验。该系统有时被称为液体芯片。通过荧光染料对这种微球（直径约5微米的塑料小球）进行内部编码，并分别用于多路复用分析的具体试验。通过流式荧光分光光度法对小球进行检测。
对微球悬浮液进行自身免疫多路复用分析通常采用Luminex公司（美国德州，Austin）开发的技术。通过该公司的xMAP技术，经荧光团编码的微球在不同的分析中起到条形码的作用。6　每个小球装置可以通过具有不同生物测定特异性的试剂进行包被，分析物由小球装置中的不同红光和近红外线荧光染料浓度确定。这样就可以对样品中的特定分析物进行捕捉和检测（图2）。分析仪通过一道激光束激活小球的内部染料（这种染料将微球分为不同类别），而另一道激光则激活报告染料（通常是B-藻红蛋白），测定过程中该激发光将被捕捉。各小球装置可以获得几十个到几百个读数。
Luminex 100流式设备通过数字信号处理技术按照预先设定的分布区域对各个微球进行分类。每个微球表面都含有多个羧基，这些羧基可以作为蛋白质共价连接的位点。通过一系列校准品对小球表面的报告染料进行定量测定。
微球具有较小的体积和较大的表面积，比平面固相芯片具有更好的反应动力学性能。而且，微球在悬浮液中的流动性也优于静态平板芯片。将样品均匀分布到所有平板芯片区域极为关键，但是对于悬浮芯片这一点却无关紧要。
目前已有多篇利用Luminex技术进行自身免疫研究的研究报道。其中一个试验同时检测了5种可提取性核自身抗原，与公认的单一试验ELISA法相比具有良好的相关性。另一个小组研究了37名干燥综合症患者血清中的抗核抗原(ANAs)和可提取性核抗原。他们分别在84%和76%的患者血清中检测到干燥综合症A抗原和B抗原(SSA和SSB)的抗体。
Bio-Rad　Laboratories公司(美国加州，Hercules)的BioPlex 2200 ANA筛查仪是一种以Luminex为基础的全自动系统，可以同时测定13种自身免疫抗体的水平。一项临床研究表明，这种ANA筛查仪的特异性与ELISA ANA筛查试验不相上下。　与ELISA试验相似，该BioPlex系统的阳性率低于用于自身抗体筛查的间接免疫荧光试验。
优点和缺点：这两种多路复用技术（悬浮和平板芯片）各有优缺。二维微芯片技术在蛋白质或核酸的高密度筛查（包括100多种的试验）方面非常出色。平板芯片尤其适用于单一试验中对从细菌到人的各种生物体的整个基因组或蛋白质组进行同时分析。微球芯片在临床试验室中的优势尤为突出，这些试验中的检测分析物都是精心设定而且通过较小的面板进行测定。
微芯片技术有时缺乏高通量临床应用所必需的重复性。这主要是因为平板芯片的制备需要序列化的生产过程。相反，微球芯片的大量生产具有平板芯片不易达到的分析重复性。
此外，平板芯片的超静定性和统计检验水平也不如微球芯片。这是因为每个测定装置在一次多路复用小球反应中通常会检测数百个微球，每个小球代表一种不同的免疫测定，而且在计算结果前即可将数据集中的异常值排除在外。
悬浮芯片有助于根据客户要求将配合基与每个小球装置进行偶合。结合在不同小球装置上的配合基可以在不同结合化学性质和反应条件下进行反应。每种配合基的纯度可能各不相同，例如有的像细胞裂解液一样，而有的像重组蛋白一样。每个小球装置与配合基之间可以使用不同的接头。最后，在每个小球装置制造时可以采用不同的包被后或封闭步骤。
微球芯片具有显著的优势：每个微球装置均以最佳方式单独加工，随后将不同的小球装置组合起来制备最终的多路复用小球试剂。
芯片检测中可以容纳大量的分析物，因此可以使用多个内部对照以确保测定系统的预期性能。自身抗体的多路复用分析中可能需要不同的对照（表II）。

相对荧光是芯片技术中常用的输出信号。可以使用荧光内部标准（独立小球装置或芯片位点）对所有测定信号进行标准化。这种标准化弥补了照明和检测系统的波动。还可以根据相应的临床标本类型及和加样容积设计自身免疫测定中的其他内部检测。这些内部对照是每个多路测定试验必须具有的功能。
多路复用检测中还可以考虑使用对一种分析物或一类分析物具有特异性的其他内部对照。例如，通过类风湿因子(RF)内部测定可以检测RF对IgM自身抗体分析的潜在干扰。检测总IgG将有助于确保IgG高丙种球蛋白标本不会由于竞争性抑制而干扰IgM分析。

图3. 采用单路和多路测定法对16种分析物进行5种代表性试验的抗体指数比较图。通过内含单球（蓝色）或16球（红色）装置的一个多组分阳性对照对分析物进行完全相同的两次测定。抗体指数等于标本的荧光读数除以校准品的荧光读数。
正确使用内部对照需要掌握分析物的相关技术问题、进行测定的基质以及所用设备的性能特点。内部对照的使用可以提高测定的精度和准确性，并且可以排除未知的矛盾结果。10
技术难点
多路复用自身免疫测定法的普遍认存在一些技术障碍。与核酸芯片相比，蛋白质芯片的开发难度更大。这是因为蛋白质在分子大小、电荷、外形、疏水性、基因转译后形成的类型和程度、以及四级结构方面具有很大区别。而且一些蛋白质连接在固相载体上后难以保持特异性和活性。
对自身抗原进行同时检测，正如使用各种免疫分析方法一样，需要合理设定的、可重复性、可调定量抗原。利用芯片技术进行自身抗原测定存在一些问题，包括如何获得芯片构建所需的功能蛋白表达、开发将蛋白质连接到载体表面并保持其活性的技术以及通过化学和检测系统同时获得较高的分析灵敏度和较大的动态范围。测定标准化、数据解释及储存也是需要考虑的问题。而且对每种分析物都需要进行性能验证。此外，由于经常存在基因转译后形成的各种变体，蛋白质化学非常复杂。
重复性：多路复用分析技术可以影响分析结果的重复性。通过对所有试剂和反应过程进行广泛优化以及重复检测可以达到较高的精度。使用平板芯片时，可能要对每种分析物的两个或多个复本尽心检测，然后对变异可接受性进行统计检验，并计算出平均值。使用球形悬浮芯片时，通常要对每种分析物的数百个小球或化验结果进行测定。一般来说，小球的数量与化验精度存在直接联系。
干扰性：芯片位点之间的相互干扰是一个严重的问题。使用平板芯片时会出现这种信号干扰，但理论上，这种干扰对微球芯片的影响更大。在微球悬浮芯片中，测定反应中心并未分割成独立的空间位点；各个小球装置在使用前有可能在液相中发生长时间的相互作用。
与微球反应的蛋白质主要通过共价键连接，但是，即使彻底清洗后通常还会有一些疏松连接的蛋白质。与小球装置非共价连接的蛋白质会从固相表面缓慢解离，并抑制液相反应物的正常反应；结果就可能出现假阴性。解离的蛋白质也可能迁移并依附到另一小球装置的表面，导致假阳性结果。
应进行全面的稳定性试验，以确保结合了配合基的蛋白质在产品保存期内都可与固相基质稳定结合。在多路分析验证阶段，必须确保多路复用分析的结果与相应的单路分析结果相当。稳定性试验最好在标称的保存期末进行，这时最容易发现问题。只有所有分析物的多路和单路分析结果都近乎相同时，研究人员才能认定小球装置的混合并未产生相互干扰(图3)。
多路复用测定中潜在的相互作用数是微球芯片中测定次数的一个函数（表III）。随着芯片复杂程度的增加，各分析之间可能发生的不良作用也快速增加。生产前必须解决这一干扰问题。

灵敏度和特异性：通过自身抗体芯片获取临床的灵敏度和特异性非常困难。自身免疫抗原通常没有显著的特点，而各种分析法中的主要反应成分在纯度、浓度及活性方面均不相同，因此很难获得等效的结果。自身抗体测定通常是在非平衡状态下进行的。各种分析法在分析动力学和热力学方面存在差异，从而产生不同的分析结果，特别是对于中等浓度的自身抗体。
从本质上说，多路复用测定法会产生多余的信息。自身抗体芯片最有价值的功能就是它可以产生自身抗体的图谱。人们希望借助计算机图谱识别软件对多路复用芯片的结果进行分析，从而进行疾病的差别性诊断。这种软件不仅可以提高诊断的准确性，还可以提高分析的通量和成本效益。此外，计算机程序还可以发现未经识别的复杂自身抗体的图谱。
目前，用于构建专家系统和解释算法的方法多种多样。图谱识别技术的诱人之处在于其假设的独立性，同时无需专家对每个结果进行主观性解释。图谱识别对受测分析物的名称或特征无任何要求。
方法多样化
在一项研究自身抗体图谱能否预测小鼠对1型糖尿病的耐受性或易感性的试验中，研究人员将一组共266种抗原点样在玻璃芯片上。抗原中的肽分别来自热休克蛋白、组织抗原、免疫系统成分、结构抗原、激素、酶、血浆蛋白、合成寡核苷酸及细菌抗原。在这组266种原始抗原中，研究人员发现一个27种抗原的组合可以将小鼠区分为化学促发型糖尿病（环磷酰胺促发型糖尿病；CAD）耐受个体和易感个体。
研究人员发现，通过自身抗体图谱可以区分CAD易感小鼠和耐受小鼠，这种鉴别甚至可以在给予促发化学物前进行。研究还发现一种自身抗体图谱可以区分健康小鼠和CAD后糖尿病小鼠；该图谱与CAD前抗原集的自身抗体图谱有所不同。因此，在糖尿病的发病中，可以通过IgG对某些抗原的反应性预测个体对于CAD的潜在易感性，而不是CAD本身。另一方面，一些IgG反应性可以预示疾病而不是易感性。因此，对潜在疾病的预测以及对当前疾病的诊断可能有赖于不同的自身抗体效价图谱。
该研究列举了定义各种风湿性疾病自身抗体图谱的多种方法。人们可能还将发现新的抗体图谱，用以预测自身免疫疾病的病变过程，或提示可取的治疗方案。
未来应用
在一些重要的未来研究和临床应用中，基于自身抗体芯片的多路复用技术前景一片光明。最明显的例子就是，为了进行有效的诊断和治疗，对可能反映某一具体自身免疫性疾病的大量抗原进行筛查。其他潜在应用包括：鉴定潜在致病性评估中的相关人IgG类型、鉴别自身免疫反应的抗原表位分布以及指导抗原图谱明确性治疗的疗程。3 多路复用测定法有助于发现尚未鉴别的自身免疫性疾病或疾病亚型的新型自身抗原。
同时还可以将这种技术用于其他医学领域，如对变应原、治疗性和滥用药物、血清抗体以及心脏病和癌症蛋白质标志物的分析。
高数值芯片（含100多种分析物）将成为研究环境中最有用的技术。通过对成百上千种试验进行多路复用，研究人员可以从与某种疾病无临床关系的大量分析物中鉴别出数量有限的自身免疫生物标志物。经过这一阶段，阵列密度低于100种分析物的蛋白质即可投入临床应用。
结论

可对自身抗体及其他分析物进行多路复用测定的全自动系统现已上市。该系统的计算机控制免疫测定开放系统分析仪能够连续、随机地调用标本和试剂，并且与实验室信息系统、原管采样及STAT功能完全整合。这种尖端产品在技术、成本和工作流程方面具有极大优势，因此采用这种新技术的设备将为您提供一种传统ELISA、免疫印迹及IFA技术之外的诱人选择。
相关帮助
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