生化工程连续培养动力学.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021,*,D=F/V,其中,F：体积流率,（体积/时间)流速,稀释率,（D）,：,体积流率与培养液体积之比。,应用：,1）单细胞蛋白、乙醇、溶剂、啤酒、废水处,理、动物细胞培养、酶催化等领域,2）生物代谢、生理、生化、遗传、生态等特性,的研究。,特征：连续培养进入稳定状态后，细胞的比,生长速率与稀释率相同，培养液中的细胞、,基质和产物浓度恒定，不随时间变化。,1,2021,2,2021,分批培养,:,底物一次装入罐内，在适宜条件下接种进行反应，经过一定时间后将全部反应系取出。,补料发酵,:,先将一定量底物装入罐内，在适宜条件下接种使反应开始。反应过程中，将特定的限制性底物送入反应器，以控制罐内限制性底物浓度保持一定，反应终止取出反应系。,3,2021,连续培养类型,恒化器,：具有恒定化学环境的反应器。以恒定不变的 速率加入某一必需的限制性营养物。,恒浊器,：维持细胞密度恒定不变。,营养恒定反应器,pH自动恒化器,CER恒化器,溶氧恒化器,摄氧恒化器,4,2021,一、单级连续培养,1、,菌体平衡,对于细胞：,体系积累速率=（进入-流出）速率+（生长-死亡）速率 （g/h）,VdX/dt=F(X,0,X)+V()X (1),对于普通的单级恒化器 X,0,=0，=0，培养液体积不变,dX/dt=(D)X,(2),其中 D=F/V,5,2021,当连续培养处于稳态时，反应器中的细胞积累为,零，即：,dX/dt=0,D=,即,在恒定状态时，比生长速率等于稀释速率,6,2021,2、,限制性底物的物料平衡,对于限制性底物：,体系积累速率（进入,流出）速率,（生长形成产物维持代谢）所消耗速率,(g/h,mol/h),V,dS/dt=F,(S,0,S)(dX/dt/Y,G,+dP/dt/Y,p,+mX),V(3),dS/dt=D,(S,0,S)(/Y,G,+q,p,/Y,p,+m),X (4),当连续培养处于稳态时，反应器中的基质的积累为零，即：dS/dt=0,D,(S,0,S)(/Y,G,+q,p,/Y,p,+m),X=0 (5),7,2021,3、,产物的物料平衡,对于产物形成：,体系积累速率=（生成 流出）速率,V,dP/dt=V,(,dP/dt),生成,F,P,dP/dt=Yp/xX D,P (6),或 dP/dt=q,p,X D P (7),当连续培养处于稳态时，反应器中的产物的积累为零，即：dP/dt=0,Yp/x X P=0,(8),或,q,p,X D P=0,(9),8,2021,单级恒化器在稳态条件下的物料平衡方程：,细胞：,D=,基质：D(S,0,S)(/Y,G,+q,p,/Y,p,+m)X=0,产物：Yp/xX P=0 或 q,p,X D P=0,在只培养细胞的特定连续培养过程中，设：,产物的形成,忽略不计，,维持代谢,忽略不计。,则有：,(1),D,=,(2)D(S,0,S)/Y,G,X=0 (10),X=Y,G,(S,0,S)=Yx/s(S,0,S),(11)X=?,Yx/s=Y,G,9,2021,根据莫诺方程=,m,S/(Ks+S),S=Ks/(,m,),(12),代入上式(11)得：,X=Yx/s,S,0,KsD/(,m,D),(13),在一定培养条件下，Yx/s、S,0,、Ks和,m,均为定值，连续培养状态下培养液中的菌体浓度X和限制性底物浓度S取决于稀释率D。,S=Ks/(,m,/,1,)=Ks/(,m,/D,1,),(14),当D,m,提高D，增大S，则降低X。,当D,m,时，SS,0,，此时X0，,临界稀释率D,crit,为：D,crit,=,m,S,0,/(Ks+S,0,),通常情况下，KsS,0,，故有：,D,crit,=,m,10,2021,生产强度(生产率）：,Pt=产物浓度（g/L）/发酵时间（h）,Pt,=X/t=F X/V=X/(V/F),=,D X,PtDYx/s S,0,KsD/(,m,D)（16）,令 Pt 对 D 的一阶导数为零，可获得最大生产强度,下的稀释率 D,opt,：,D,opt,=,m,1,Ks/(Ks+S,0,),1/2,（17）,11,2021,对函数,PtDYx/s S,0,KsD/(,m,D)求极值,令Pt(D,opt,)=0,12,2021,13,2021,14,2021,15,2021,m,=1.0 h,-1,Ks=0.2 g/L,Yx/s=0.5 gX/g S,S,0,=10 g/L,16,2021,例题6.1,以葡萄糖为限制性基质，连续培养,E.coli,，在此培养条件下(流加基质浓度S,0,=0.968g/L)，测得试验数据如下：,D(h,-1,),S(mg/L),X(mg/L),D(h,-1,),S(mg/L),X(mg/L),0.06,6,427,0.6,122,434,0.12,13,434,0.66,153,422,0.24,33,417,0.69,170430,0.31,40,438,0.71,221,390,0.43,64,422,0.73,210,352,0.53,102,427,试比较连续培养的S、X和Pt的理论计算值和实验值。,17,2021,根据莫诺方程有：1/=1/,m,+Ks/,m,1/S,对1/1/S作线性回归曲线，求得：,m,=1.05h,-1,，Ks=0.0997g/L=99.7mg/L,将实验数据X、S和D代入方程,X=Yx/s(S,0,S),和,Pt=D X,，计算对应的Yx/s和Pt，结果见下表：,18,2021,D(h,-1,),Yx/s(g/g),Pt(g/h),D(h,-1,),Yx/s(g/g),Pt(g/h),0.06,0.44,0.026,0.6,0.52,0.260,0.12,0.45,0.052,0.66,0.52,0.278,0.24,0.45,0.10,0.69,0.55,0.297,0.31,0.47,0.136,0.71,0.50,0.277,0.43,0.47,0.181,0.73,0.47,0.257,0.53,0.49,0.226,19,2021,取0.3 D0.7之间的Yx/s数值的平均值得：,Yx/s,均,0.505 gX/gS,将所求出的,m,、Ks和Yx/s,均,作为理论计算的依据，依据下列方程作图：,S=KsD/(,m,D),X=Yx/s,均,(S,0,KsD/(m,D),Pt=DYx/s,均,(S,0,KsD/(,m,D),该例连续培养的理论计算值和实验值拟合图见下图,。(Excel 6.1),20,2021,D 0.25D,crit,，不可忽略维持代谢,D 0.75D,crit,可能产生代谢产物。,21,2021,例6.2,在甘露糖醇中培养大肠杆菌，其动力学方程为：dX/dt=1.2SX/(2+S)g/(Lmin)。已知 S,0,6 g/L，Yx/s=0.1。试问（1）当甘露糖醇溶液以1 L/min的流量进入体积为5L的CSTR中进行反应时，其反应器内细胞的浓度及其生长速率为多少？（2）如果寻求使大肠杆菌在CSTR内的生长强度达到最大，试问最佳加料速率应为多少？大肠杆菌的生长速率为多大？,22,2021,解（,1）,根据题意，单级CSTR在稳态下有，,D=F/V=1/5=0.2 min,-1,依据莫诺方程,m,S/(Ks+S)得，,0.2=1.2S/(2+S),S=0.4 g/L,由 XYx/s(S,0,S)得，,X=0.1（6 0.4）0.56 g/L,由 dX/dt=X 得，,dX/dt=0.20.560.112 g/(Lmin),23,2021,（2）生产强度Pt=D,Yx/s,S,0,Ks,D/(,m,D),令dPt/dD=0，此时Pt为极大值，相应的稀释率为,D,opt,=,m,1,(Ks/(Ks+S,0,),1/2,=1.21,(2/(2+6),1/2,=0.6 min,-1,最佳加料速率 F=D,opt,V=0.65=3 L/min,dX/dt=0.60.16,20.6/(1.2,0.6),=0.24 g/(L.min),24,2021,二、多级连续培养,把几个生物反应器串连起来，前一级反应器的出,料作为下一级反应器的进料，即组成了多级连续,培养系统。进行多级连续培养时，也可以向第二,级以后的各级反应器补充新培养基。,25,2021,26,2021,第二级反应器反应动力学,X,V,(dX,2,/dt),体系,=F,(X,1,X,2,)+V,2,X,2,(dX,2,/dt),体系,=D,(X,1,X,2,)+,2,X,2,稳态下：,2,=D,(1X,1,/X,2,),(1),由于X,2,X,1,0，因此,2,D,27,2021,S,V dS,2,/dt=F(S,1,S,2,)V(dX,2,/dt),/Yx/s,dS,2,/dt=D(S,1,S,2,),2,X,2,/Yx/s,稳态下：,2,=Yx/s D(S,1,S,2,)/X,2,(2),已知 X,1,Yx/s (S,0,S,1,),(3),联立方程（1）、(2)和（3），求得：,X,2,=Yx/s（S,0,S,2,）(4),依据莫诺方程得,2,=,m,S,2,/(Ks+S,2,)(5),联立方程（2）和（5），求得,X,2,=Yx/s D(Ks+S,2,)(S,1,S,2,)/(,m,S,2,),(6),S,1,，S,2,？,28,2021,联立方程（4）和（6），得：,Yx/s (S,0,S,2,)=Yx/s D(Ks+S,2,)(S,1,S,2,)/(,m,S,2,),(S,0,S,2,)=D(Ks+S,2,)(S,1,S,2,)/(,m,S,2,)(7),将方程S,1,=Ks D/(,m,D)代入方程（7），得二次方程：,(,m,D)S,2,2,(,m,S,0,Ks D,2,/(,m,D)+Ks D)S,2,+Ks,2,D,2,/(,m,D)=0,解此方程求出S,2,，进而确定X,2,。,29,2021,30,2021,D(X2X1),31,2021,稳态下第n级反应器中的细胞浓度、比生长速率、限制性基质浓度和产物浓度：,X,n,=D,X,n-1,/(D,n,),n,=D,(1X,n-1,/X,n,),S,n,=S,n-1,n,X,n,/(D,Yx/s),P,n,=P,n-1,+q,p,X,n,/D,32,2021,三、进行细胞回流的单级连续培养,将单级恒化器中流出的培养液进行分离，经浓缩,后的细胞悬浮液被送回反应器中。,提高了反应器中细胞的浓度,提高了反应器操作的稳定性,单级反应器,临界稀释率 D,crit,=,m,33,2021,物料循环比,（体积比）：=Fr/F 1,流速、生物量、基质浓度？,34,2021,35,2021,对反应器（不包括分离器）进行物料衡算：,对于细胞：,积累速率（进入流出）速率（生长死,亡）速率循环液细胞流入速率,V,dX/dt=F,X,0,(1+),F,X+V,(),X,+FX,dX/dt=,X 1+,(1),D,X,(X,0,=0，=0，培养液体积不变）,当连续培养处于稳态时，反应器中的细胞积累为零，即：dX/dt=0,=D,1+,(1),(1),36,2021,对于限制性基质：,积累速率（进入 流出）速率,（生长形成产物 维持代谢）所消耗速率由循环液进入速率,V,dS/dt=F,S,0,(1+),F,S,V,(dX/dt/Y,G,+dP/dt/Yp+mX)+FS,dS/dt=D,(S,0,S)X/Yx/s,（不考虑产物形成和维持代谢）,37,2021,当连续培养处于稳态时，反应器中的底物积累为零，即：dS/dt=D,(S,0,S)X/Yx/s,=0,X=Yx/s,D,(S,0,S)/(2),将=D,1+,(1)代入(2)得：,X=Yx/s,(S,0,S)/1+,(1),X=Yx/s,(S,0,S)/R,(3),其中R为循环浓缩因子,R=1+,(1),1,S?,38,2021,根据莫诺方程有：S=Ks,/(,m,),将(1)式代入上式，得,S=Ks,R,D/(,m,R,D),(4),将(4)式代入(3)式得：,X=1/RYx/s,S,0,Ks,R,D/(,m,RD),(5),39,2021,A、B、C 循环；D、E 不循环；A、D 反应器中细胞浓度X；,B、E 细胞生产率（生产强度）D X；C 出口细胞浓度X,m,=1.0h,-1,，Yx/s=0.5g/L，Ks=0.2g/L，S,0,=10g/L，=2，=0.5,40,2021,临界稀释率条件下，X0，S S,0,，依据Monod方程,R,D=,m,S,0,/(Ks+S,0,),D,crit,=1/R,m,S,0,/(Ks+S,0,),一般Ks S,0,，,故,D,crit,=,m,/R ,m,R,=/D=1+,(1),41,2021,在上例中，,m,=1.0h,-1,，=2，=0.5,R=1+（1）0.5,D,crit,=,m,/R,2 D,crit,由于0R1，D,crit,m,依据方程（1）得,/D=1+(1),浓缩比越大，达到一定/D所需的循环比越小；反之则越大。,42,2021,例6.3,在一带循环的单级CSTR（连续操作的搅拌槽式反应器）中进行下述反应，dX/dt=2SX/(1+S)g/(L.min),已知X,0,=0，S,0,=3g/L，,F=1 L/min，Yx/s=0.5，V=1 L，Fr=1/2 F，,Xr=4Xe。,试求：X，S，Xe各为多少？,Ks，,m,，?,43,2021,解：循环比Fr/F=0.5，,Xe=(1+)F X F X/F,=1+(1)X,Xr/Xe=X /(1+(1)X=4,=2,循环浓缩因子R=1(1)0.5,D=F/V=1 min,-1,44,2021,由于该反应服从莫诺方程，dX/dt=2SX/(1+S)得：Ks=1，,m,=2,由S=Ks R D/(,m,R D)，得,S=10.51/(20.51)=1/3 g/L,由X=1/R Yx/s(S,0,S），得,X=1/0.50.5(31/3)=8/3 g/L,由Xe=1+(1)X，得,Xe=0.58/3=4/3 g/L,45,2021,四、连续培养的应用,1、确定,最佳培养条件,最大生产强度Pt=D X,最高转化率 Yx/s,最少副产物产生,从右图中，得到什么结论？,46,2021,47,2021,2、富集、选育特殊性状的菌种,建立高选择性的环境条件，筛选和富集培养专一性的微生物,筛选的环境条件包括：限制性底物、培养温度、pH、生长促进剂、抑制性物质等。,在选择性富集培养过程中，生长速率不同菌种的“去”“留”由各自的比生长速率决定，最后系统保留的是在该体系中比生长速率最大的微生物。,48,2021,设一连续培养微生物 X 的过程中被 Y 或 Z 或W 微生物污染。其中杂菌 Y在给定的限制性底物S中的比生长速率,Y,X,，杂菌 Z 在S中的比生长速率,Z,X,，而杂菌 W 在S中的比生长速率,W,与,X,的大小差异与S的浓度有关,。三种杂菌Y、Z、W在连续培养中与微生物X的生长关系如下图所示。,49,2021,50,2021,根据连续培养理论，某种微生物在培养过程中的积累速率为生长速率与稀释速率之差（不考虑菌体死亡，进入的速率为零）：,细胞积累速率生长速率 流出速率,dX/dt=X D X,对于杂菌Y，在一定S下，,Y,小于正常培养微生物X条件下的稀释率D，因,dY/dt=,Y,Y D Y,且,Y,D，故 dY/dt 为负值。结果杂菌Y不能残存在培养系统中。,51,2021,对于杂菌Z，在一定S下，,Z,大于正常培养微生物X条件下的稀释率D，因,dZ/dt=,Z,ZD,Z,且,Z,D，故 dZ/dt 为正值。结果杂菌Z残存在培养系统中。由于dZ/dt0，微生物Z积累，结果导致限制性底物浓度S的下降，下降至S时，有,Z,D，对于微生物Z,建立了一个在S下的新稳定状态。在S下，微生物X的,X,随S下降至S，而下降至,X,，此时,X,D，微生物X将从培养系统中洗出。,52,2021,对于杂菌 W，W 的残存决定于操作稀释率，在D=0.25D,crit,时，W不可能与X竞争，如Y与X的情形，W终被 洗处；当D=0.75 D,cri,t时，X不可能与W竞争，如Z与X的情形，X终将被洗出，W在系统中残存。,53,2021,3、连续发酵与产物的形成,研究限制性底物种类、浓度与产物形成之间的关系。,表6.3 在连续培养中链球菌变异株由葡萄糖生成乳酸,限制性营养物,稀释率（h,-1,）,细胞产酸力（g,p,/g,x,),比产物生成速率（g,p,/g,x.,h),乳酸,(g/L),葡萄糖,0.017,5.4,0.092,4.0,葡萄糖,0.034,6.1,0.21,4.0,葡萄糖,0.051,6.0,0.31,3.8,氮源,0.034,26.3,0.89,10.0,磷酸盐,0.034,80.0,2.7,4.8,54,2021,4、生产强度（培养细胞）,连续培养的最大生产强度,Ptm Yx/s,m,S,0,（若,S,0,Ks）,分批培养的生产强度：,生产周期：t,B,=t,L,+1/,m,lnX,F,/X,0,+t,R,+t,P,t,B,分批培养一个生产周期所需的时间,t,L,延迟期占用时间 t,R,放料占用时间,t,P,清洗反应器，重新加入培养基、灭菌、冷却等操作所需时间,分批培养的细胞生产强度：,Pt,B,=(X,F,X,0,)/t,B,=Yx/sS,0,/(t,L,+1/,m,lnX,F,/X,0,+t,R,+t,P,),55,2021,连续培养与分批培养的生产强度之比：,Ptm/Pt,B,=lnX,F,/X,0,+,m,(t,L,+t,R,+t,P,),56,2021,连续培养的优缺点,优点：,1)可用于进行细胞代谢、生理生化和遗传特性的研究。,2）提高生产效率。,3）产物质量比较稳定。,4）连续培养所需设备和投资少，而且便于自动化。,57,2021,缺点：,1）长时间培养过程中，菌种易老化、变异，工程菌质粒易丢失和染杂菌等。,2）培养液中产物浓度较低，分离成本高。,3）新加入的培养基与原有的培养基不易完全混合，影响培养和营养物质的利用。,58,2021,