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PCR技术的原理与方法技术的原理与方法 钟召迪PCRPCR定义定义l l 聚 合 酶 链 反 应(Polymerase Chain Reaction)简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。l l 是指在DNA 聚合酶的催化下，以母链DNA 为模板，一特定引物为延伸起点，经过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出于母链模板DNA互补的子链DNA的过程。l l 可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等。PCRPCR反应特点反应特点l l特异性强l l灵敏度高l l简便、快速l l对标本的纯度要求低PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理l lPCR的反应成分l lPCR的反应基本步骤l lPCR的反应体系PCRPCR的反应成分的反应成分l l模板DNA l l引物l l四种脱氧核糖核苷酸l lDNA聚合酶l l反应缓冲液，Mg2PCRPCR的反应基本步骤的反应基本步骤l lPCR的反应基本步骤l l变性：高温使双链DNA解离成单链（94 ，30s）l l退火：低温下，引物与DNA模板互补区结合（55 ，30s）l l延伸：中温延伸，DNA聚合酶催化以引物为起点的DNA链延伸反应（7072 ，3060s）PCRPCR的反应体系的反应体系 10扩增缓冲液 1/10体积 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物(2个)0.2umol/L 模板DNA 102 105 Taq DNA聚合酶 1 2.5单位/反应体系 Mg2+1.52.5mmol/L 加双或三蒸水至 25 50ulPCRPCR反应五要素反应五要素l l引物（primer）l l 酶（Taq DNA polymerase）l l dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）l l模板（template）l lMg2+（magnesium）引物引物l l引物是PCR特异性反应的关键l lPCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度l l理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增引物设计的原则引物设计的原则l l引物最好在模板cDNA的保守区内设计l l引物长度一般在1530碱基之间l l引物GC含量在40%60%之间，Tm值最好接近72l l引物3端要避开密码子的第3位l l引物3端不能选择A，最好选择Tl l碱基要随机分布l l引物自身及引物之间不应存在互补序列引物设计的原则引物设计的原则l l引物5 端和中间G值应该相对较高，而3 端G值较低l l引物的5端可以修饰，而3端不可修饰l l扩增产物的单链不能形成二级结构l l引物应具有特异性酶及其浓度酶及其浓度l l目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成基因工程酶：大肠菌合成l l一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100 ul时）l l浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少dNTP dNTP 的质量与浓度的质量与浓度dNTPdNTP的质量与浓度和的质量与浓度和 PCRPCR扩增效率有密切关系扩增效率有密切关系dNTPdNTP呈颗粒状，呈颗粒状，保存不当易变性失活保存不当易变性失活dNTPdNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH1M NaOH或或1M Tris-HCl1M Tris-HCl的缓冲液将其的缓冲液将其pHpH调节到调节到7.07.07.57.5，小量分装，小量分装，-20-20冰冻保存。多次冰冻保存。多次冻融会使冻融会使dNTPdNTP降解降解在在PCRPCR反应中，反应中，dNTPdNTP应为应为5050200umol/L200umol/L，尤，尤其是注意其是注意4 4种种dNTPdNTP的浓度要相等（等摩尔配的浓度要相等（等摩尔配制制 ），），如其中任何一种浓度不同于其它如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低浓度过低又会降低PCRPCR产物的产量产物的产量dNTP dNTP 能与能与MgMg2+2+结合，使游离的结合，使游离的MgMg2+2+浓度降低浓度降低模板（靶基因，模板（靶基因，target genetarget gene）l l模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一l l传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K 来消化处理标本SDS SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，核蛋白，SDS SDS 还能与蛋白质结合而沉淀还能与蛋白质结合而沉淀蛋白酶蛋白酶K K 能水解消化蛋白质，特别是与能水解消化蛋白质，特别是与DNADNA结合的组结合的组蛋白蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸MgMg2+2+浓度浓度l lMg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响l l在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜l lMg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少PCRPCR反应条件的选择反应条件的选择 PCR反应条件:温度 时间 循环次数温度与时间的设置温度与时间的设置l l设置变性-退火-延伸三个温度点l l标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸l l对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法，将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸变性温度与时间变性温度与时间l l变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因l l一般9394lmin足以使模板DNA变性 若低于93则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。l l此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败退火退火(复性复性)温度与时间温度与时间l l退火温度是影响PCR特异性的较重要因素l l变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞l l退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度l l对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想延伸温度与时间延伸温度与时间l l延伸温度：一般选择在延伸温度：一般选择在70707575之间之间 常用温度为常用温度为7272 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。l l延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb 1Kb以内的以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min（足够）（足够）3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34min4min 扩增扩增10Kb10Kb需延伸至需延伸至15min15minl l延伸进间过长会导致非特异性扩增延伸进间过长会导致非特异性扩增l l对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些循环次数循环次数l l循环次数 决定PCR扩增程度l l循环次数 主要取决于模板DNA的浓度l l循环次数：选在3040次之间l l循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多谢谢！谢谢！