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抗除草剂基因工程与抗除草剂
转基因小麦的研究进展

1　抗除草剂基因工程研究概况

通过化学方法来控制杂草已成为现代化农业不可缺少的一部分, 除草剂的年产量已居农药之首, 据估计美国每年用在除草剂上的费用大约是50 亿美元。由于除草剂作用机理是影响植物生理生化过程, 如光合作用、氨基酸的合成等, 因此除草剂在消灭杂草的同时也对作物具有伤害作用, 这就限制了除草剂的应用。以往解决除草剂对作物伤害问题主要是: (1) 应用对作物伤害小的除草剂和施用方法。(2) 通过杂交育种, 把和栽培作物亲缘关系近的野生植物对除草剂抗性的基因引入到栽培品种。由于作物栽培种和近缘种通常不具备有抗除草剂的特性, 这种育种方法存在局限性。随着生物技术的发展, 目前, 用遗传工程方法来培育抗除草剂的作物品种已成为人们控制杂草的主要方法。近10 余年来, 随着对除草剂作用机制的深入了解以及基因分离转化技术的迅速发展, 植物抗除草剂基因工程取得了较大的成功, 已从链霉菌、突变的烟草等生物体分离出抗除草剂基因。
1.1　抗除草剂基因工程的技术策略
目前, 抗除草剂基因工程主要采取两种策略:
(1) 修饰除草剂作用的靶蛋白使其对除草剂不敏感或过量表达, 作物吸收除草剂后仍能进行正常代谢作用。
草甘膦(Glypho sate, 商品名Dupound) 是一种非选择性, 广谱的高效、低毒有机膦除草剂。它特异性地抑制植物和微生物芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸) 合成途径中52烯醇丙酮酸莽草酸232磷酸合酶(5-eno lpyruvyl-sh ik imate-3-pho sphate synthase, EPSPS) 的活性, 导致芳香族氨基酸缺乏, 莽草酸积累, 最终导致细胞死亡。1985 年Camai 等[1, 2 ]首先从鼠伤寒沙门氏菌中筛选出了抗草甘膦的突变菌株, 随后分离出突变基因( aroA 基因) 并将此突变的aroA 基因转入烟草细胞获得第一个抗草甘膦转基因作物。后来F illat t i 等[3 ]将此基因转入番茄, 获得转基因番茄。1986 年Shah 等[4 ]培育并筛选出具有对草甘膦抗性的矮牵牛细胞系M P42G, 能超量产生EPSPS 合成酶, 并分离出EPSPS 合成酶基因, 转入矮牵牛属的叶圆片获得转化愈伤组织, 其EPSPS 合成酶的活性提高了40 倍。目前已获得抗草甘膦的烟草[2, 5 ]、矮牵牛、番茄、大豆、小麦[7 ]等。
磺酰脲类除草剂和咪唑酮类除草剂, 都是通过抑制支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸) 合成中乙酰乳酸合酶(aceto lactate synthase, AL S) 来表现除草剂的作用。1988 年, Haughn 等[8 ]通过转基因手段已将拟南芥植株的AL S 的突变基因引入烟草, 这一转基因植物产生了对除草剂的抗性。对抗绿磺隆转基因作物研究也较多[9～ 11 ] , 我国学者李国圣等[12, 13 ]将拟南芥的AL S 基因导入玉米, 已进入田间试验。
(2) 引入酶或酶系统, 在除草剂发生作用前将其降解或解毒。草丁膦(Pho sph ino th ricin) 是非选择性的广谱除草剂Basta 的活性成分。
草丁膦除草作用机理是抑制植物的氨基酸生物合成酶—谷氨酰胺合成酶(GS) , GS 可以解除硝酸盐还原、氨基酸降解及呼吸中释放出的氨的毒性。虽然草丁膦抑制细菌、植物及哺乳动物的GS, 但它不能进入哺乳动物的血液和脑组织, 因此草丁膦对哺乳动物是安全的[14 ]。乙酰CoA 转移酶(acetyl CoAtransferase) 催化草丁膦的自由氨基乙酰化, 从而使除草剂草丁膦失活。1987 年Thomp son 等[15 ]从链霉菌(S trep tom y ces hy g roscop icius) 分离出bar 基因615 bp , 编码草丁膦乙酰CoA 转移酶(PA T )。另外来自S trep tom y cesv irid och rom og enes 的pat 基因约113 kb, 编码PA T 的基因在其中的BgË 2SstÊ 片段上[16 ]。两种基因产物有相似的催化能力, 氨基酸序列86% 同源。PA T 表达量占总可溶性蛋白的010001% 时足以使植物产生抗草丁膦抗性。目前已经将bar 基因转入多种作物如烟草[17 ]、番茄[18 ]、马铃薯[19 ]、水稻[20～ 23 ]、小麦[24～ 27 ]等。
溴苯腈(B romoxyril) 是除草剂Buct ril 的活性成分, 抑制光系统Ê 电子传递, 它对于生长素2, 42D 不能控制的杂草特别有效。从土壤细菌臭鼻杆菌(K lebsiel la oz aenae) 中分离出溴苯腈降解基因bxn, 编码腈水解酶, 该酶把溴苯腈转变为无活性产物3, 52二溴242羟基苯甲酸。另外, gox 基因编码的草甘膦氧化还原酶, 能把草甘膦降解成无毒成分。tfDA基因, 编码2, 4-D 单氧化酶, 能将2, 4-D 降解为非光和毒性的2, 4-二氯苯, 也在选育抗性作物中获得成功表达。
一般认为, 引入外源酶使除草剂失活的策略比靶位点突变的策略优越。因为靶标酶或靶标蛋白质的过量产生会给作物造成代谢负担, 对作物的生长和产量不利, 而且靶酶的改变, 其异构酶的活性通常会降低, 甚至对转基因作物有害。外源酶的引入负效应要小, 并且降解系统产生的对除草剂的抗性专一性强、效率高。
1.2　抗除草剂基因工程的应用

1.2.1　将除草剂基因导入作物中培育抗除草剂作物　抗除草剂转基因作物的研究主要集中于美国各大农药公司或与有关的遗传单位合作研究开发, 因为通过对除草剂作物品种的研究, 一方面扩大公司除草剂的销售, 另一方面又可出售种子。目前国外转基因抗除草剂作物商品化的有: 抗草甘膦的大豆、玉米、棉花、油菜、向日葵、甜菜, 抗草丁膦的大豆、玉米、棉花、油菜、甜菜、水稻, 抗咪唑啉酮的玉米、油菜、甜菜、水稻, 抗磺酰脲类的大豆、棉花, 抗拿扑净玉米, 抗溴苯腈的棉花、烟草。我国从事抗除草剂基因工程研究的单位有多家, 获得的抗除草剂转基因作物有: 抗Basta 水稻[22 ]、小麦、烟草、油菜、芝麻等, 抗阿特拉津大豆, 抗溴苯腈油菜、小麦, 抗草甘膦小麦。

1.2.2　利用抗除草剂基因作为遗传转化的选择标记基因　将抗除草剂基因与其它目的基因(如抗虫、抗病基因) 构建到同一载体上 导入作物中, 转化体若表现出对除草剂的抗性, 说明抗除草剂基因整合到作物基因组中, 也间接说明目的基因也整合到作物基因组中。bar 基因是迄今为止用得最多的一个抗除草剂选择标记基因, 已成功地用于小麦、水稻[20, 21 ]、玉米、大麦、油菜等作物的转化。另外, 作为选择标记基因, 抗草甘膦的aroA 基因、抗溴苯腈的bxn 基因和抗绿磺隆的csrl 基因等也成功地用于不同作物的遗传转化。

1.2.3 抗除草剂基因在作物杂种优势及其它方面中的应用　利用杂种优势是提高作物产量与质量最为有效的途径之一。在创造作物雄性不育工程植株中, 若转化基因不是单基因纯合显性表现时, 则其与保持系的杂交后代发生分离现象, 一些植株雄性不育, 一些则雄性可育。如将抗除草剂基因与不育系基因构建在一起, 一并导入植株, 培育出抗除草剂的不育系, 只要在苗期喷施除草剂, 没有转化的植株或假杂种就会死去, 剩下的就是不育系或真杂种。例如曹光诚、傅荣昭等将抗除草剂基因bxn 或bar 与雄性不育基TA29-barnase 串联在一起构建到植物表达载体上, 导入作物, 实现了作物转基因雄性不育材料的保持。另外, 将抗除草剂基因转移到恢复系中, 培育出带有纯合抗性基因的恢复系。这样在制种过程中产生的假杂种, 就可以通过使用除草剂除去。中国水稻研究所黄大年等成功地用基因枪法将bar 基因导入三系杂交水稻或二系杂交水稻的恢复系, 使恢复系获得抗除草剂基因, 具备抗除草剂特性, 再用所得到的转基因恢复系与三系不育系或二系不育系杂交, 生产杂交水稻种子。这样就解决了杂交水稻种子纯度不够所致的生产上无法使用的问题, 并能够及时清除假杂种植株。
1.3　抗除草剂基因工程应注意的问题
在进行抗除草剂基因工程时, 不仅要考虑到转基因食品对人体的安全, 而且要注意抗除草剂基因工程特有的问题:(1) 在抗除草剂转基因研究中, 所抗的除草剂对环境的问题。所抗的除草剂首先应是广谱、低毒、低残留、低挥发性及环境“温和”型, 并且不易在土壤中淋溶, 以免进入地下水和土壤的底土。(2) 抗除草剂基因所带来的作物生长势和产量下降的问题。应选择编码使除草剂失活的外源酶基因(如bar 基因) , 因为引入编码靶标酶或靶标蛋白质的基因(如EPSPS
基因) 会产生过量的酶或蛋白给作物造成代谢负担, 对作物的生长和产量不利。(3) 抗性作物品种使用过程中与杂草可能发生自然杂交的遗传问题。当杂草和除草剂抗性作物亲缘关系接近时, 通过自然杂交, 基因可以从作物流入亲缘关系近的杂草。因此在作物种植区如果存在有亲缘关系近的杂草, 则不应种植抗除草剂品种。(4) 抗除草剂作物的应用可能导致单一作物品种的连作, 降低了对除草剂敏感的作物与这些转基因作物实行轮作和混作的可能性。这就可能导致农业生态系统中作物种植多样性的匮乏, 从而为那些生长不受遏制的杂草、害虫和疾病提供了最佳环境。而且通过增强除草剂的有效性,抗除草剂作物将会进一步降低作物种植的多样性, 反而有利于杂草群落的形成和发展, 有利于对广谱除草剂产生适应的竞争性物种快速进化。另外, 抗除草剂作物本身成为杂草的问题。如在收获过程中掉落在土壤中的籽粒, 可能成为轮作中后茬作物的田间杂草。

2　抗除草剂转基因小麦的研究进展

转基因植物自20 世纪80 年代开始研究, 如何将转基因技术应用于小麦、水稻、玉米等农作物一直是人们努力的目标之一。要实现这一目标, 首先需要建立高效、可靠、重复性好的基因转化系统。在植物基因转化系统研究方面, 由于禾谷类作物是单子叶植物, 不是土壤农杆菌的天然寄主, 所以长期以来农杆菌介导转化只是局限在双子叶植物范围内。近年来,人们对农杆菌转化植物细胞的原理及步骤进行了系统研究, 发现农杆菌确实能侵染许多包括重要禾本科植物在内的单子叶植物, 如水稻、玉米、大麦、小麦。但总体上来说, 单子叶植物在遗传转化效率落后于双子叶植物。在禾谷类作物中, 由于小麦原生质体培养困难, 因此小麦相对于其它作物(如水稻、玉米、甘蔗等) 又进一步表现出滞后性, 直到1992 年V asil才首次报道了抗除草剂转基因小麦植株的再生。近几年来, 随着组织培养、基因表达系统、转化方法的进步, 以及抗除草剂基因的发现和分离, 抗除草剂小麦转基因已取得了较大的发展。
2.1　小麦抗除草剂遗传转化的主要方法—基因枪法
近10 年来, 国内外学者进行了大量的研究, 建立了多种小麦遗传转化系统。小麦遗传转化方法很多, 虽然有些方法如原生质体法、电激法、子房注射法、花粉管通道法、激光微束穿刺法及碳化硅纤维法( silicon carbide fibermediated) 等也能得到转化细胞或转化基因植株, 但到目前为止基因枪法在小麦的转化上是应用最广泛的。下面从受体材料的选择、轰击参数及筛选系统作一介绍。

2.1.1　受体材料的选择　虽然V asil[25 ]在1992 年以5～ 7 个月愈伤组织作为受体材料, 首次获得抗除草剂转基因小麦的再生植株, 但该材料培养时间长、难鉴别和难保持, 因此该方案除了费时, 不易重复外, 还有转化植株成熟度与可育性等问题。随后研究者们尝试了预培养不同天数的幼胚或其愈伤组织, 如V asil,W eek s[26, 27 ]等采用未成熟胚和未成熟胚的初生愈伤组织。但是, 从开始培养到转基因小麦植株的获得需要7～ 9 个月的时间, 而且转化率不足1%。1994 年Becker等用未经预培养的幼胚, N eh ra 等用预培养2 d 的离体盾片组织, 2 种方案都获得高于1% 的转化率。离体盾片组织提高了转化细胞的体细胞胚的再生, 从开始培养后的3～ 4 个月内后产出了完全可育的转基因小麦植株。但从幼胚上剥下盾片却有些麻烦。我国学者也采用了预培养不同时间的幼胚, 获得到了转基因的成功。如王小军、黄粤、梁辉采用预培养3～ 5 d 的未出愈的幼胚, 认为幼胚培养2～ 3 d, 盾片就明显膨大, 4 d 后幼胚快速增殖, 7～ 10 d 后就出现胚状体, 因此采用快速增殖前期的培养3～ 4 d 的幼胚盾片作为转化受体轰击后可立即进入细胞旺盛分裂及形成胚状体期, 并且此时的受体对轰击伤害也具有较强的耐受力, 有利于外源基因的整合及转化植株的获得。陈梁鸿认为幼胚以诱导培养15 d, 幼穗以诱导培养16 d 的转化效果好, 而且幼穗来源的愈伤组织比幼胚来源更耐继代。这些不同的观点, 可能与组织培养、基因枪轰击时不同的参数有关。离子轰击所造成的损伤的耐受性来说, 预培养时间长的比预培养时间短的材料好。总的来说, 目前小麦基因枪转化的受体材料多是培养5～ 9 d 的幼嫩盾片愈伤组织或预培养3～ 5 d 的尚未出愈的幼胚。

2.1.2　轰击参数　基因枪轰击参数主要是指所用基因枪的种类(涉及轰击时的气压、距离、速度等) , 所用的金属粒子种类、DNA 沉淀辅助剂及DNA 的纯度、质粒DNA 与金属粒子之比、每枪粒子用量等。基因枪有3 种, 目前常用的是放电式基因枪和气动式基因枪。轰击用的金属粒子多为金粉和钨粉。常用的DNA 辅助沉淀剂是氯化钙、亚精胺、聚二乙醇等。DNA 的纯度越高越容易获得转化的成功。质粒DNA 与金属粒子之比以及每枪使用的金属颗粒的量, 现有报道有些差异。如梁辉认为1 Lg DNA ö500 Lg 金粉、每枪250 Lg 金粉颗粒较好, 安海龙采用1 LgDNAö600 Lg 金粉、500 Lg 金粉颗粒较好, 周淼平认为1 Lg DNA ö3 00 Lg 金粉、42 Lg 金粉颗粒较好, 同Becher和A ltpeter[25]的观点相一致。总之, 从30～ 600 Lg 都有成功的报道。DNA 用量过多导致微弹严重结块, 从而影响转化率, 过少则导致被轰击的靶细胞获得外源DNA 的机率减少。高金属颗粒用量对细胞造成伤害严重, 影响转化细胞的生长和分裂甚至造成细胞的死亡, 而且金属密度过高, 易聚积成块, 分散不好。总之, 最适合的金属粒子用量主要是轰击损伤(细胞损伤) 和轰击效率(接受粒子的细胞数) 两者之间的平衡的结果, 而这一平衡受到轰击时基因枪的种类、金属颗粒的凝集程度、所用组培系统、筛选系统的影响。为获得较高的转化率, 在避免对细胞造成较大轰击伤害的同时应尽量增加DNA 与金属颗粒用量。一般每皿轰击二次。为减轻轰对受体的损伤, 一般在轰前4～ 6 h 到轰后16 h 范围内将小麦的材料置于0.4～ 0.6mo löL 渗透剂(苷露醇或山梨醇) 的培养基上进行渗透处理, 并且在轰击后的渗透处理之后转至不含筛选剂的愈伤组织诱导培养基上5～ 7 d, 作受体材料的恢复培养。

2.1.3　筛选系统　小麦遗传转化研究中应用最广泛的选择标记基因是抗除草剂bar 基因, 它既可作标记基因也可作目的基因, 其筛选剂有pp t, Basta 和B ialapho s 三种。EPSPS 和Bxn 基因也是除草剂抗性基因, 用相应的除草剂草甘膦和溴苯腈作为筛选剂也已成功应用于小麦的遗传转化。此外np tÊ、hp t 也可作选择标记基因, 其筛选剂分别为G418 和潮霉素。小麦遗传转化的筛选策略一般有两种, 一是通过连续筛选获得抗性愈伤组织(大概需要筛选2～ 3 个月) , 然后再分化抗性植株, 筛选过程中存在一个抗性愈伤组织阶段。如1992 年V asil 的实验。另一种是经过一定时间的筛选后(大概筛选20～ 25 d) , 将尚处于嵌合状态的愈伤组织直接转入分化, 筛选过程中不存在一个抗性愈伤组织阶段。如N eh ra 的实验。由于严格意义上的小麦抗性愈伤组织比较难获得, 而获得这种抗性愈伤组织所需要时间较长, 因此后来工作者一般多采用后一策略来进行小麦抗性植株的筛选。从V asil 第一次成功地进行小麦的遗传转化至今, 近10 年的时间基因枪法转化小麦已成为一种相当成熟的技术。基因枪法转化具有无宿主限制, 能转化任何一种作物, 靶受体广泛, 能转化任一组织或细胞并且操作简便等优点。但这一方法费用较高, 并且转化率较低

2.2　小麦抗除草剂转化存在的主要问题
(1) 再生系统: 成功的遗传转化依赖于良好受体系统, 而这一切是通过组织培养途径来实现的。目前, 小麦的组织培养仍存在很多问题。首先, 基因型的依赖性很强, 只有很少品种再生频率较高。因此人们在研究中多采用几个模式品种,而一些农艺性状较好的栽培品种往往因无法建立良好的再生体系而不能使用。其次, 在小麦组织培养过程中对胚性愈伤组织的筛选、保持和调控往往靠经验, 因而增加了培养的难度。再者, 培养小麦植株所需时间较长, 所得植株易出现白化苗或畸形苗, 造成植株育性降低。因此组织培养作为小麦基因工程的基础, 有必要进一步深入研究。
(2) 基因表达系统: 外源基因在细胞中表达受多种因素的影响, 如外源基因在植物基因组中的整合位点, 被导入基因的拷贝数, 基因表达载体的的调节序列等。经过多年的研究, 发现可通过引入高效率的启动子来增强外源基因的表达, 但外源基因整合位点、拷贝数到目前为止还没有有效的方法进行控制, 因此在这一方面也需进一步研究。
(3) 转化方法: 虽然基因枪法、农杆菌法及原生质体法在小麦遗传转化中都有应用, 但各种方法都存在一定的缺陷。
如何结合各种方法的优点, 对原有方法改进则是人们研究的又一课题。
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