高温曲中产酱香细菌分离及筛选试验.doc

高温曲中产酱香细菌的分离和筛选试验
1.产酱香细菌的分离
1.1采样：曲样放入无菌袋密闭及时送实验室，用无菌小刀切开曲块，将大曲外中内层混合均匀，粉碎后备用。
1.2平板分离培养基：
分离培养基：营养琼脂（g/l）或葡萄糖蛋白胨培养基：
牛肉膏5 蛋白胨10 氯化钠5 琼脂15-20 或蛋白胨5 葡萄糖5 K2HPO4 5
高盐培养基：牛肉膏5 蛋白胨10 氯化钠60 琼脂15-20 PH均为7.2-7.4
斜面培养基：牛肉膏5 蛋白胨10 氯化钠5 琼脂15-20
种子培养基：酵母膏5 蛋白胨10 氯化钠10或蛋白胨5 葡萄糖5 K2HPO4 5
筛选培养基：麸皮99g 葡萄糖1g 加水70ml 高压灭菌30min
或麦粒培养基：小麦粉碎成麦粒麦粉各半，加水1:1.0-1.2 润浸18h，经蒸熟 冷却 打散，称取30-50g/250ml三角瓶，高压灭菌45min。
1.3产酱香菌分离：高温培养法 热处理培养法 高盐培养法
1.3.1高温培养法：取1.0g曲粉加入99ml/250ml生理盐水，150r/min 30min，适当稀释，取三个梯度涂布于营养琼脂培养基 45-50℃培养24h.
1.3.2热处理培养法：1.0g曲粉加入50ml/250ml种子培养基中，37℃ 150r/min富集培养24h，80-85热处理20min，适当稀释，取三个梯度涂布于营养琼脂培养基37℃培养24h.
1.3.3高盐培养法：取1.0g曲粉加入99ml/250ml生理盐水，150r/min 30min，适当稀释，取三个梯度涂布于营养琼脂培养基37℃培养24h.
分离结果与讨论：
高温培养法：花瓣状 光滑状 毛绒状三种
热处理培养法：花瓣状 毛绒状两种
高盐培养法：光滑状 毛茸状 乳头状 水滴状
高温法 热处理法 高盐法
菌落总数：x106 50 1 4
高温法耐受高温细菌和高温处于休眠的芽孢，高盐法除芽孢菌外，还有一些耐高盐的微生物。制曲过程中，随制曲温度的升高，水分蒸发，微生物处于高渗高盐状态，部分耐盐微生物生长良好。
1.4产酱香细菌的筛选：
从三种方法分离得到菌株中选取不同形态菌株各三个进行培养，通过对发酵产物的感观评价筛选出产酱香的细菌。
将分离纯化的不同的单菌落接种于种子培养基中，37℃ 200r/min培养24h.吸取1ml加入麦粒培养基三角瓶中，按37℃ 50℃ 60℃温度梯度依次培养48h（14d），感观评定，选择产酱香较好的菌株作为鉴定菌株。
1.5产酱香细菌的鉴定
对28株供试菌株发酵后感观评定筛选出4株产酱香明显的细菌L1 L2 L3 L4
菌落形态：
项目 L1 L2 L3 L4
形状 不规则 圆形 丝状 圆形
大小（cm） 0.2---0.4
边缘 不规则 整齐 波状 整齐
表面 皱褶 光滑 皱褶 皱褶
干湿 干燥 湿润 干燥 干燥
透明 不 不 不 不
粘性 无 有 无 无
光泽 无 无 无 无
颜色 灰白 灰白 灰白 灰白
附着程度 易挑 易挑 易挑 易挑
菌苔特征：
丰厚 丰满 丰满 丰满 丰满
边缘 突起 突起 突起 突起
粘性 无 有 无 无
透明 不 不 不 不
光泽 无 无 无 无
颜色 灰白 灰白 灰白 灰白
生长特征：
菌膜 + + + +
浑浊 - - - -
沉淀 - - - -
形体特征：
形状 杆状 杆状 杆状 杆状
两端钝圆
革兰染色 + + + +
位置 中生 中生 中生 中生
芽孢 孢囊 不膨大 不膨大 不膨大 不膨大
形状 圆柱 圆柱 圆柱 圆柱
鞭毛 周生 周生 周生 周生
不同温度生长：
温度 30℃ 40℃ 50℃ 60℃ 70℃
L1 + ++ +++ +++ +
L2 + ++ +++ +++ +
L3 + + ++ ++ -
L4 + + ++ ++ -

不同PH下生长：
PH 3 5 7 9 11
L1 - ++ +++ ++ -
L2 - ++ +++ + -
L3 - + ++ + -
L4 - + ++ + -
糖醇发酵：
菌株 葡萄糖 蔗糖 乳糖 半乳糖 阿拉伯糖 木糖 三梨糖 甘露醇
L1 + + - + + + + +
L2 + + - + + + + +
L3 + + - + + + + +
L4 + + - + + + + +
菌株其他生理生化试验特征：
过氧化氢酶 + + + +
厌氧生长 + + + +
丙酸盐利用 + + + +
V-P反应 + + + +
硝酸盐还原 + + + +
卵磷脂酶 + + + +
7℅氯化钠 + + + +
石蕊牛奶产酸 - - - -
淀粉水解 + + + +
明胶水解 + + + +
酪素水解 + + + +
PH5.7生长 + + + +
1.6分析与讨论：
四株细菌属于枯草芽孢杆菌群，类似地衣芽孢杆菌，种群组成单一。均在50-60℃生长较好，在菌落形态和生理特征有一定差异，其主要形状相同的。

2011.5.30
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