CTC检测技术.ppt

shworth TR.Aust Med J,1869,14:146-147Allard WJ,et al.Clin Cancer Res,2004,10:6897-6904循环肿瘤细胞的特性循环肿瘤细胞的特性Wu et al.Clin Chem Lab Med 2013,10.1515Allard,W.J.et al.Clin Cancer Res 2004;10:6897-6904循环肿瘤细胞的特性循环肿瘤细胞的特性Mego,M,Nat.Rev.Clin.Oncol.2010 细胞表面抗原标志物表达差异携带不同的分子信息转移潜力差异异质性异质性循环肿瘤细胞的特性循环肿瘤细胞的特性Bednarz-Knoll,et al.Cancer Metastasis Rev(2012)31:673687CTCs可以是间质型、上皮型、上皮间质混合型、成团的CTCs(CTM)Breast Cancer：N Engl J Med 351:781-791,2004Prostate Cancer:Lancet Oncol 10:233-239,2009Colorectal Cancer:J Clin Oncol 26:3213-3221,2008CTC对于无进展生存期与总生存期的有效预测CTCs检测的临床可行性检测的临床可行性实时实时 方便方便 及时及时 准确准确 微创微创 如何检测CTCs？CTCs的富集：如何获取CTCs？每10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞，而10mL血液中含有的白细胞约有1亿个，红细胞有500亿个。从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞CTCs的鉴定：如何鉴定所获细胞为CTCs？将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常上皮细胞、造血干细胞等区分开来循环肿瘤细胞的检测循环肿瘤细胞的检测CTCs检测技术检测技术Harouaka R,Kang Z,Zheng SY,et al.Pharmacol Ther.2014 Feb;141(2):209-21.原 理技术产品免疫捕获法(根据细胞表面标志物)阳性富集法：CellsearchTM系统CTC芯片（CTC-chip）MACSCell Separation阴性筛选法：Easy SepCyttel过滤法(根据细胞大小)ISET膜过滤 密度梯度离心（根据细胞密度）OncoQuick分离体系流式细胞检测法无CTCs的检测方法及代表技术产品的检测方法及代表技术产品免疫捕获法磁珠分选u原理：将特异性抗原包被在已有同源二抗的磁珠上制成免疫磁珠再与靶细胞上抗抗原结合成“靶细胞抗原抗体磁珠”复合物，在磁场作用下向一定方向移动，从而富集靶细胞.u分选策略阳性富集：使用表面耦联抗目的细胞抗体的磁珠，细胞与磁珠结合后直接在磁场中被分离出来。负性筛选：通过去除无关细胞使目的细胞得以纯化阳性富集CellsearchTM系统/CTC芯片CTC-chip）/MACSCell Separation 磁性细胞分选系统l原理：采用抗EpCAM（CD326）结合免疫磁珠捕获EpCAM阳性CTCsl特点：捕获的CTCs纯度较高 能够捕获到血液中上皮型、上皮间质混合型的CTCs 无法捕获到间质型CTCs（EpCAM阴性）magnet Anti-EpCAM Coated ferrofluids7.5mlAnti-CK(epithelial cells)Anti-CD45(WBCs)DAPI(viable cells)Automated fluorescence detection systemmagnet使用抗EpCAM抗体抗体包被磁微粒使其与肿瘤细胞结合，在特定磁场作用下达到分离CTC的目的。阳性富集阳性富集-CellsearchTMCTCWBCCellsearchTM CTCs鉴定鉴定CTCs的判定：DAPI（细胞核）阳性、角蛋白CKs阳性、CD45阴性Cellsearch在各癌种中的检出率芯片的表层排布了78 000个包被抗 EpCAM抗体的微位点血液样本流经芯片时，抗体与肿瘤细胞结合粘附在芯片上阳性富集阳性富集-CTCs-Chip原理原理：联合上皮细胞标志及肿瘤特异性标志通过免疫磁珠分选特异性肿瘤的CTCs联合抗MUC1和EpCAM抗体检测乳腺癌和直肠癌通过RT-PCR扩增肿瘤标志物来鉴定CTCs特点特点：较单一使用EpCAM抗体更特异不适用于EpCAM和CK阴性或弱化的CTCsPCR鉴定敏感性高，但易造成假阳性阳性富集-Adna Test 检测系统免疫捕获技术缺陷（一代技术）技术应用分析技术应用分析参考文献参考文献CTCs分离具有特定表面抗原分离效率高，纯度高J Transl Med.2012,10:138.Clin Cancer Res.2011,17(2):337-45.间质细胞表型CTC间质细胞表型CTC不表达上皮细胞标志物（如EpCAM）Breast Cancer Res.2008,10(4):R69.BMC Cancer.2012,12:178.CTMCTM多为间质细胞表型CTM体积大导致捕获效率低操作步骤多易使CTM人为分散Am J Pathol.2011,178(3):989-96.Cancers.2010,2,1236-1250.血小板包裹CTC抗体与抗原结合受血小板包裹阻隔Cancer Cell.2011,20(5):576-90.CTCs分型只分离获得特定类别的CTC，因此无法分型CTCs分析只能分析特定类别的CTC阴性富集Cyttel/Cytelligen 检测系统原理原理:利用CD45磁珠抗体吸附白细胞，在磁场作用 下去除白细胞，CTCs被富集沉淀特点：特点：可检出EpCAM、CK阴性的间质型CTCs 样本处理步骤多，CTCs易丢失阴性筛选法-Cyttel步骤较多，CTCs容易丢失鉴定不稳定 判定标准：DAPI阳性、CD45阴性，8号染色体扩增；特异性不足基于细胞大小过滤u原理：根据肿瘤细胞的体积大于白细胞体积分离CTCu代表技术：滤膜滤法分离上皮源肿瘤细胞（ISET）u方法：将全血经过带小孔8m的聚碳酸酯膜的过滤，即可除去白细胞 富集得到CTCs.u特点：细胞完整性好；可完全分离上皮型、间质型CTCs；可检出循环肿瘤拴子；局限：不宜检出细胞直径小于8m的肿瘤如神经内分泌瘤HepG2 cells stained with anti-KL1滤膜法滤膜法密度梯度离心原理：根据肿瘤细胞与白细胞密度不同，通过梯度离心分离CTCsOncoQuick分离体系方法：密度梯度离心后，白细胞通过多孔滤膜被滤除，而CTCs被富集在介 质层中，洗脱后得到CTCs.特点：可分离CK阳性和阴性细胞局限性：CTCs迁移可能至血浆层、红细胞层和粒细胞层而丢失；CTCs微栓子可能沉入红细胞层而丢失；与肿瘤细胞特性、离心时间和温度等有关；用血量多15-30ml流式细胞术原理：根据白细胞表达CD45抗原、CK阳性CTCs表达EpCAM，采用不同荧光素标记的抗CD45和抗EpCAM，通过流式细胞术分析和分选CK阳性细胞的CTC（CD45-EpCAM+）可在检测的同时进行细胞形态、DNA倍数分析敏感性较低，需要的血液样本量大缺乏规范的临床操作方法技术技术优势优势局限性局限性阳性率阳性率样本量样本量参考文献参考文献CellsearchTM特异性好、重复性好、可自动化不能分型、漏检转移侵袭能力较强的间质型CTCs及CTM71%（MBC）47%（MCRC）78%（AIPC）7.5mLN Engl J Med.2004，351:781-91.J Clin Oncol.2008,26:3213-3221.Clin Cancer Res.2008,14:6302-6309.CTCs-chip(HB-chip)特异性好、灵敏度高、HB芯片可富集到CTM不能分型、漏检转移侵袭能力较强的间质型CTCs93%(MPC )0.9-5mlPNAS.2010,107:1839218397 Cyttel可检测出EpCAM、CK阴性的CTC、未对CTC进行任何标记不能分型、鉴定不稳定、鉴定时易发生CTCs丢失64.5%(NSCLC)5mL周小昀,癌症进展.2010,8(5):484-490.ISET膜过滤CTC丢失少、适用于CK阴性肿瘤、适用于形态学、免疫学和基因特异性分析不适合小神经内分泌肿瘤细胞、特异性低、残留大的白细胞80%（BC）1-15mlClin Cancer Res.2010,16(20):50115018.常见CTCs一代检测技术的比较临床实践亟需临床实践亟需新技术新技术实现实现CTCs分离、分型、分析分离、分型、分析先分离后鉴定，采用上皮+间质标志物进行鉴定，不同表型的CTC均能检出。技术原理CanPatrolTM-CTCs高效捕获癌种例数阳性例数阳性率中位值均值SD CTCs范围非小细胞肺癌 33028687%4 9190-240肝癌51139577%4 8110-83结直肠癌30224079%3 690-76乳腺癌21818484%4 8110-120胃癌14812886%5 890-46鼻咽癌1259677%2 460-33宫颈癌1574172%4 7110-62肾癌1459867%2 340-52膀胱癌987783%2 6130-43前列腺癌866980%3 44 0-32食管癌292793%5 890-43骨肉瘤373389%6 14200-95胰腺癌211886%4 9110-36子宫内膜癌1212100%6 781-29头颈癌262181%2 35 0-23卵巢癌11982%2 320-7黑色素瘤66100%5 1111 3-26肠癌5480%6 540-11恶性淋巴瘤5360%1 10210-48甲状腺癌6583%2 32 0-7胸腺癌66100%4 78 1-21间质瘤22100%7 76 3-11口腔癌11100%13 13壶腹癌33100%9 12122-26胆管癌22100%4 432-6恶性纤维组织细胞瘤22100%2 211-3肉瘤8788%4 550-12脑瘤88100%5 89 2-27其他癌种776078%4 690-46共计2554209482%4 7120-240数据更新至数据更新至2015-01同步实现同步实现CTCsCTCs鉴定与分型鉴定与分型CTCs精准分型深入评估复发转移风险精准分型深入评估复发转移风险间质型CTCs转移能力比上皮型、混合型CTCs强CTM的转移成瘤能力是单个CTCs的20-50倍 ：CTCs的全面深入分析 ：CTCs的全面深入分析 ：CTCs全基因组测序CanPatrolTM 技术特点和创新技术特点和创新CanPatrolTM二代二代CTC检测技术检测技术高效分离所有类型CTCsp采用特制纳米滤膜，且不依赖于特定的上皮标志物，可高效、全面分离所有类型CTCs适用于绝大多数实体瘤p采用国际公认8m孔径滤膜法截留CTCs，适用于绝大多数实体瘤最大程度保留原始信息：p物理法（过滤）使CTCs形态及分子信息保存完整，利于深入分析唯一实现分型分析的CTC检测技术：p高灵敏度RNA-ISH技术，结合上皮、间质两组特异性RNA探针，实现CTCs精准分型CTCs检测技术小结检测技术小结基于免疫捕获原理（如以EpCAM等抗体进行阳性筛选）的技术，富集获得的CTC纯度较高，但多项研究均发现该类方法很容易漏掉那些最具有侵袭潜能的肿瘤细胞（间质型CTCs及CTM）；阴性筛选法鉴定不稳定，不能进行分型，同样会发生CTCs丢失；密度梯度离心法也会发生CTCs及CTM的丢失；研究证明ISET法对间质型CTCs 及CTM的富集效果比免疫捕获法好。ISET法亦会丢失CTCs，主要是直径小于滤膜孔径的CTC，和存活状态不好甚至是因凋亡而萎缩的CTCs，因此其丢失的大部分CTC是侵袭性较弱的。ISET法的另一个不足是获得的CTC纯度较低，但结合第二种富集参数可显著提高纯度；CanPatrolTM唯一实现CTCs全面分离、精准分型和系统分析的二代CTC检测技术；CTCs助力肿瘤实时个体化治疗助力肿瘤实时个体化治疗