第二章 实验室设置及一般技术(2学时).doc

第二章 植物细胞工程实验室设置及一般技术一实验室设置细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。1基本实验室（1）准备室：准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。（2）接种室：接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外，应行密闭。（3）培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，有的还需要有可调节的空气湿度。培养室应保持干燥和清洁。准备室,宽敞明亮,通风效果好.无菌室,封性好,干燥清洁,保持无菌,应防空气对流培养室,控温,控光,空气干燥清洁2辅助实验室（1）细胞学实验室：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。（2）摄影室及暗室：其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。（3）生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。细胞工程实验室布局的其基本要求是：便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。二实验室所需的设备、用具1基本设备：冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。2灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。3无菌操作设备：净化工作台、接种箱。4光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器。5细胞培养设备：培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。6细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。7. 培养器皿及实验用具玻璃器皿：新型材料器皿：玻璃漏斗、量筒、试管、锥形瓶、吸管、烧杯、试剂瓶等金属材质用具：剪刀、镊子（弯头、平头）、眼科剪、眼科镊、滤器等。三. 常用技术（一）洗涤技术植物组织培养最重要的，也是最基本的要求，就是各项操作都应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养过程中最经常、最大量的工作之一，是洗涤培养瓶及其它常用器皿。在清洗器皿处应有较大的水池，水池应用水泥制作，白瓷砖砌内外表面，池底另放一张橡胶垫，以减少器皿破损。自来水龙头宜采用三孔鹅颈式的，用水方便，并在需要时可加装抽滤器。下水道应畅通，以免妨碍工作。除水池外，还需辅助以若干盆与桶。洗瓶时先将瓶子在清水中泡一会儿，然后在水龙头下涮去瓶内污物，沥干水，泡入浓洗衣粉水中，再用瓶刷沿瓶壁上下刷动和呈圆周旋转两个方向刷洗。瓶外也要刷到，不要留下未刷到之处。刷后放到水龙头下用流水冲刷4次，以彻底冲去洗衣粉残留物。洗好的瓶子应透明锃亮，内外壁水膜均一，不挂水珠，即表示无污迹存在。通常无须乎再用蒸馏水涮一遍，直接放入洁净的大果菜篮中，再置搁架上沥晾水汽，这可能是最省事、最节约又少占空间的办法。也可制作晾洗架，瓶子倒放在孔格中或挂在小木棍上，这样洗后要摆一遍瓶子，用时再收一次瓶子。急等使用的瓶子可以用烘箱烘干。烘时缓慢升温，温度也无须太高。 1洗涤液铬酸洗涤液是用重铬酸钾(K2Cr2O7)与硫酸(H2SO4)配制而成，可根据需要配制成弱、中、强三种。弱：用重铬酸钾50g加入蒸馏水1L，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸90ml。中：用重铬酸钾50g加入蒸馏水100ml，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸875ml。强：与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾，直到重铬酸钾达到饱和为止。一般浓硫酸1L加入重铬酸钾50g。2洗涤方法2.1 新玻璃器皿洗涤：先用自来水刷洗，再用5稀盐酸浸泡，以中和玻璃表面的碱性物质赫其他有害物质。2.2 使用过的玻璃器皿的清洗（1） 使用过的玻璃器皿应立即浸入清水，避免干涸难洗。（2） 洗涤剂洗净后，浸酸性洗液过夜。（3） 从酸性洗液捞出后自来水洗净，蒸馏水刷洗3次，凉干后高压灭菌。2.3 塑料用品洗涤塑料用品一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较强，因此冲洗时必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗。2.4 橡胶用品的清洗：浸泡，2%NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，1%HCl浸泡30min，流水冲洗，蒸馏水煮沸20min，三蒸水冲洗23次，晾干或烘干。2.5 金属用品洗涤金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，并保持干燥。（二）灭菌、消毒技术我们所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物，这些东西很小，肉眼是根本看不见的，在条件适宜时它们大量孳生，这时能看到它们的集合体或形成的菌落，飘散的孢子等等。菌的特点是无孔不入，无处不有，在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖能力极强，不采用适当的方法很难除灭它。但是它们也有自身的弱点，我们就采用适当的办法消灭它们，这些方法我们就叫做灭菌或消毒。物理方法：干热、湿热（最有效的一种灭菌方法，主要应用范围是布类、橡胶类、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品、加热后不发生沉淀的无机溶液。湿热灭菌时，灭菌锅应留有30%的空间，不可装得太满，否则因压力与湿度不对应，造成灭菌不彻底。如三角瓶等间隙较大，可以多放一点。）、射线处理（60Co、X射线）、紫外线消毒、过滤、离心沉淀等化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌1培养基灭菌：植物细胞与组织培养的培养基采用高压灭菌和过滤灭菌两种，高压灭菌通常为121，30min。动物细胞与组织培养由于用到小牛血清、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压灭菌（如TdR，秋水仙素、谷氨酰胺、异硫氰酸胍等）。只能用滤过除菌。培养基要求比较严格，既要保证灭菌彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，因此不能随意延长时间和增加压力。琼脂在长时间灭菌后凝固力会下降，以致不凝固。2玻璃器皿灭菌：玻璃器皿可任选湿热和干热灭菌方法灭菌。湿热灭菌条件与培养基灭菌条件一致，但要适当延长灭菌时间，一般以2530分钟为宜。湿热灭菌后器皿和包装表面常常有水蒸气覆盖，如果不及时干燥常常容易微生物的再侵染，因此，器皿灭菌后应及时放入净化工作台上吹干。干热灭菌即在烘箱中加热至160180后恒温保持40分钟，或120灭菌2小时。玻璃器皿放入烘箱之前必须完全干燥，以免引起破碎，灭菌时温度要缓慢上升，灭菌后待温度逐渐下降到60以下时才能开箱门，以免器皿因突然冷缩而破碎。3金属用具灭菌：镊子、剪刀、解剖刀、接种针等金属制品，使用前和使用过程中均必须灭菌并保持无菌状态。使用前的灭菌可采用干热灭菌。使用过程中的灭菌通常是将其浸泡在70%的酒精中，再以火焰将酒精烧去，待冷却后使用。4接种室灭菌：常用化学消毒法进行灭菌。（1）来苏而水灭菌；（2）0.5过氧乙酸；（3）乳酸蒸汽；（4）37甲醛加高锰酸钾。向甲醛内加入高锰酸钾，促进甲醛的快速挥发。无菌室应定期用70%酒精或0.5%苯酚喷雾降尘和消毒，用2%新洁尔灭抹拭台面和用具(70%酒精也可)，用福尔马林(40%甲醛)加少量高锰酸钾定期密闭熏蒸，配合紫外线灭菌灯(每次开启15分钟以上)等等消毒灭菌手段，以使无菌室经常保持高度的无菌状态。接种箱内部也应装有紫外线灯（注意：紫外线不能穿透玻璃，它的灯管是石英玻璃，而不是硅酸盐玻璃制成的），使用前开灯15分钟以上照射灭菌，但凡是照射不到之处仍是有菌的。在紫外线灯开启时间较长时，可激发空气中的氧分子缔合成臭氧分子，这种气体成分有很强的杀菌作用，可以对紫外线没有直接照到的角落产生灭菌效果。由于臭氧有碍健康，在进入操作之前应先关掉紫外线灯，关后十多分钟即可入内。（75%酒精或3%来苏儿作用原理：使空气中灰尘颗粒沉降下来），其实只要严格无菌操作手续，在门窗敞开的室内，有一超净台的保护，接种的污染率仍可控制在生产上可以容忍的水平。5外植体灭菌：通常的消毒方法是先用75的乙醇将茎尖浸泡3060s，再用升汞浸510min，最后用无菌水冲洗数次。需要注意的是，灭菌后的材料应立即接种培养，否则会造成二次感染，同时对于茎芽、花等组织材料，灭菌后若不立即接种培养，即会影响其生活力而使培养失败。从灭菌处理完成后进入净化工作台操作开始，操作人员必需严格按无菌操作规则完成以后的步骤，否则会造成外植体污染。几种常用消毒剂的效果比较消毒剂使用浓度()消毒时间(分)效果残液去除难易次氯酸钙10530好易次氯酸钠25530好易新洁尔灭1020530好易氯化汞0.11210最好最难过氧化氢1012515较好最易抗菌素450mg/L3060较好较难（三）无菌接种技术