第二章 实验室设置及一般技术(2学时).doc

第二章 植物细胞工程实验室设置及一般技术
一．实验室设置
细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。
1．基本实验室
（1）准备室：准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。
（2）接种室：接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外，应行密闭。
（3）培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，有的还需要有可调节的空气湿度。培养室应保持干燥和清洁。

准备室,宽敞明亮,通风效果好.
无菌室,封性好,干燥清洁,保持无菌,应防空气对流
培养室,控温,控光,空气干燥清洁

2．辅助实验室
（1）细胞学实验室：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。
（2）摄影室及暗室：其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。
（3）生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。
细胞工程实验室布局的其基本要求是：便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。
二．实验室所需的设备、用具
1．基本设备：冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。
2．灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。
3．无菌操作设备：净化工作台、接种箱。
4．光温控制设备：时间程序控制器、空调及温度感应器。
5．细胞培养设备：培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。
6．细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。
除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。
7. 培养器皿及实验用具
玻璃器皿：
新型材料器皿：玻璃漏斗、量筒、试管、锥形瓶、吸管、烧杯、试剂瓶等
金属材质用具：剪刀、镊子（弯头、平头）、眼科剪、眼科镊、滤器等。
三. 常用技术
（一）洗涤技术
植物组织培养最重要的，也是最基本的要求，就是各项操作都应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养过程中最经常、最大量的工作之一，是洗涤培养瓶及其它常用器皿。在清洗器皿处应有较大的水池，水池应用水泥制作，白瓷砖砌内外表面，池底另放一张橡胶垫，以减少器皿破损。自来水龙头宜采用三孔鹅颈式的，用水方便，并在需要时可加装抽滤器。下水道应畅通，以免妨碍工作。除水池外，还需辅助以若干盆与桶。
洗瓶时先将瓶子在清水中泡一会儿，然后在水龙头下涮去瓶内污物，沥干水，泡入浓洗衣粉水中，再用瓶刷沿瓶壁上下刷动和呈圆周旋转两个方向刷洗。瓶外也要刷到，不要留下未刷到之处。刷后放到水龙头下用流水冲刷4次，以彻底冲去洗衣粉残留物。洗好的瓶子应透明锃亮，内外壁水膜均一，不挂水珠，即表示无污迹存在。通常无须乎再用蒸馏水涮一遍，直接放入洁净的大果菜篮中，再置搁架上沥晾水汽，这可能是最省事、最节约又少占空间的办法。也可制作晾洗架，瓶子倒放在孔格中或挂在小木棍上，这样洗后要摆一遍瓶子，用时再收一次瓶子。急等使用的瓶子可以用烘箱烘干。烘时缓慢升温，温度也无须太高。
1．洗涤液
铬酸洗涤液是用重铬酸钾(K2Cr2O7)与硫酸(H2SO4)配制而成，可根据需要配制成弱、中、强三种。
弱：用重铬酸钾50g加入蒸馏水1L，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸90ml。
中：用重铬酸钾50g加入蒸馏水100ml，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸
875ml。
强：与浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾，直到重铬酸钾达到饱和为止。
一般浓硫酸1L加入重铬酸钾50g。
2．洗涤方法
2.1 新玻璃器皿洗涤：先用自来水刷洗，再用5％稀盐酸浸泡，以中和玻璃表面的碱性物质赫其他有害物质。
2.2 使用过的玻璃器皿的清洗
（1） 使用过的玻璃器皿应立即浸入清水，避免干涸难洗。
（2） 洗涤剂洗净后，浸酸性洗液过夜。
（3） 从酸性洗液捞出后自来水洗净，蒸馏水刷洗3次，凉干后高压灭菌。
2.3 塑料用品洗涤

塑料用品一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较强，因此冲洗时必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗。
2.4 橡胶用品的清洗：浸泡，2%NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，1%HCl浸泡30min，流水冲洗，蒸馏水煮沸20min，三蒸水冲洗2~3次，晾干或烘干。
2.5 金属用品洗涤
金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，并保持干燥。
（二）灭菌、消毒技术
我们所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物，这些东西很小，肉眼是根本看不见的，在条件适宜时它们大量孳生，这时能看到它们的集合体或形成的菌落，飘散的孢子等等。菌的特点是无孔不入，无处不有，在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖能力极强，不采用适当的方法很难除灭它。但是它们也有自身的弱点，我们就采用适当的办法消灭它们，这些方法我们就叫做灭菌或消毒。
物理方法：干热、湿热（最有效的一种灭菌方法，主要应用范围是布类、橡胶类、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品、加热后不发生沉淀的无机溶液。湿热灭菌时，灭菌锅应留有30%的空间，不可装得太满，否则因压力与湿度不对应，造成灭菌不彻底。如三角瓶等间隙较大，可以多放一点。）、射线处理（60Co、X射线）、紫外线消毒、过滤、离心沉淀等
化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌
1．培养基灭菌：植物细胞与组织培养的培养基采用高压灭菌和过滤灭菌两种，高压灭菌通常为121℃，30min。动物细胞与组织培养由于用到小牛血清、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压灭菌（如TdR，秋水仙素、谷氨酰胺、异硫氰酸胍等）。只能用滤过除菌。
培养基要求比较严格，既要保证灭菌彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，因此不能随意延长时间和增加压力。琼脂在长时间灭菌后凝固力会下降，以致不凝固。
2．玻璃器皿灭菌：玻璃器皿可任选湿热和干热灭菌方法灭菌。湿热灭菌条件与培养基灭菌条件一致，但要适当延长灭菌时间，一般以25～30分钟为宜。湿热灭菌后器皿和包装表面常常有水蒸气覆盖，如果不及时干燥常常容易微生物的再侵染，因此，器皿灭菌后应及时放入净化工作台上吹干。干热灭菌即在烘箱中加热至160～180℃后恒温保持40分钟，或120℃灭菌2小时。玻璃器皿放入烘箱之前必须完全干燥，以免引起破碎，灭菌时温度要缓慢上升，灭菌后待温度逐渐下降到60℃以下时才能开箱门，以免器皿因突然冷缩而破碎。
3．金属用具灭菌：镊子、剪刀、解剖刀、接种针等金属制品，使用前和使用过程中均必须灭菌并保持无菌状态。使用前的灭菌可采用干热灭菌。使用过程中的灭菌通常是将其浸泡在70%的酒精中，再以火焰将酒精烧去，待冷却后使用。
4．接种室灭菌：常用化学消毒法进行灭菌。（1）来苏而水灭菌；（2）0.5％过氧乙酸；（3）乳酸蒸汽；（4）37％甲醛加高锰酸钾。
向甲醛内加入高锰酸钾，促进甲醛的快速挥发。
无菌室应定期用70%酒精或0.5%苯酚喷雾降尘和消毒，用2%新洁尔灭抹拭台面和用具(70%酒精也可)，用福尔马林(40%甲醛)加少量高锰酸钾定期密闭熏蒸，配合紫外线灭菌灯(每次开启15分钟以上)等等消毒灭菌手段，以使无菌室经常保持高度的无菌状态。接种箱内部也应装有紫外线灯（注意：紫外线不能穿透玻璃，它的灯管是石英玻璃，而不是硅酸盐玻璃制成的），使用前开灯15分钟以上照射灭菌，但凡是照射不到之处仍是有菌的。在紫外线灯开启时间较长时，可激发空气中的氧分子缔合成臭氧分子，这种气体成分有很强的杀菌作用，可以对紫外线没有直接照到的角落产生灭菌效果。由于臭氧有碍健康，在进入操作之前应先关掉紫外线灯，关后十多分钟即可入内。（75%酒精或3%来苏儿作用原理：使空气中灰尘颗粒沉降下来），其实只要严格无菌操作手续，在门窗敞开的室内，有一超净台的保护，接种的污染率仍可控制在生产上可以容忍的水平。
5．外植体灭菌：通常的消毒方法是先用75％的乙醇将茎尖浸泡30～60s，再用升汞浸5～10min，最后用无菌水冲洗数次。
需要注意的是，灭菌后的材料应立即接种培养，否则会造成二次感染，同时对于茎芽、花等组织材料，灭菌后若不立即接种培养，即会影响其生活力而使培养失败。从灭菌处理完成后进入净化工作台操作开始，操作人员必需严格按无菌操作规则完成以后的步骤，否则会造成外植体污染。
几种常用消毒剂的效果比较
消毒剂
使用浓度(％)
消毒时间(分)
效果
残液去除难易
次氯酸钙
10
5～30
好
易
次氯酸钠
2～5
5～30
好
易
新洁尔灭
10～20
5～30
好
易
氯化汞
0.1～1
2～10
最好
最难
过氧化氢
10～12
5～15
较好
最易
抗菌素
4～50mg/L
30～60
较好
较难
（三）无菌接种技术