细胞膨胀-抓取及扩展压力：一种阻抗研究.doc

细胞肿胀、癫痫和扩散性抑制：阻抗的研究

摘要：细胞从发病前到发病这一个过程目前还不十分确定。在这个以清醒并瘫痪的老鼠为对象的研究中，
我们为所有老鼠准备了EEG/阻抗电极和静脉导管。在随后的一天里，老鼠们瘫痪，在通风条件下，我们用经常可以诱发癫痫放电剂量的印防已毒素、红藻酸
、氟代来治疗老鼠。我们现在知道基线阻抗的增加是由于红藻氨酸，基线阻抗更小的增加是由于印防已毒素。我们还知道，癫痫放电发生在小的、加速上升的阻抗前面。基线阻抗的增加与非发作的高频率的脑电活动有很大的关系。
结论：在癫痫的惊厥模型中，脑细胞肿胀有个加速度，并且扩散抑郁样活动与癫痫有很大的关系。

关键词：大脑皮层、 大白鼠、 氟柠檬酸、 红藻氨酸、 印防已毒素、星形胶质细胞

细胞从癫痫前过渡到癫痫这中某些过程是知道的，包括网络效应和细胞外离子浓度的变化（Jefferys，1990年）。在体内(Andrew, 1991)和体外(Traynelisand Dingledine, 1989; Dudek et al., 1990; Jefferys, 1995，)通过增加细胞大小和减小额外的细胞体积，在低渗透压条件下易发作癫痫，这是为大家普遍接受的，但是涉及到细胞体积大小或细胞外药物的发展和其他癫痫模型还没有被广泛研究。

推测复杂的多基因在不同类型的离子通道的干扰或很少，已知突变的电压门控或配体门控离子通道基础原发性癫痫（和其他一些）
。在许多情况下，确定的突变被认为或证明可以改变神经兴奋性，无论是通过增加激励或伤害抑制。我们建立这样一个被广泛认同的癫痫模型：通过把大脑暴露给已知的包括一个无序频谱的全身性药物来提高兴奋性。具体来说，我们用系统的惊厥剂来诱导癫痫电图，印防己毒素（GABA氯离子通道拮抗剂）和红藻氨酸（红藻氨酸和AMPA受体激动剂）（Willoughbyet al., 1995, 1997），我们在大脑皮层的星形胶质细胞中注射毒素钠氟代也诱导了继发性全身癫痫（（造成可逆的，星形细胞代谢的选择性破坏(Paulsen et al.,1987）)。皮层内注射氟引起电图的排放，或一定比例的癫痫发作（(Largo et al., 1996; Willoughby et al., 2003b）。
额外的细胞体积的影响脑跨阻抗电流在20-100 kHz范围内的阻抗变化与脑细胞外的空间，其中已增加或减少渗透措施（Ranck, 1964; Traynelis and Dingledine,1989; Chebabo et al., 1995），电阻抗，因此，提供一种非侵入性的技术，允许估计细胞大小的相对变化，正在越来越多地采用量化细胞外液量的方法，在癫痫的研究历史悠久（Van-Harreveld and Schade, 1962; Shalit, 1965; Elazaret al., 1966）和家禽与电击诱发癫痫发作（Savenije et al., 2000）最近的一项研究中，有一个从细胞外基量减少5.5％。阻抗的方法，也正在为人类的大脑在使用（Yerworth et al., 2002）。外体积减少癫痫发作过程本身也得到了很好的展示了采用四甲基法（Lux et al., 1986）。

在这个完整的大鼠惊厥药物治疗的研究中，我们使用电阻抗法，以确定是否有参与的细胞肿胀导致过渡到扣押的进程。我们发现三个潜在的重要组成部分细胞肿胀，可能在癫痫和偏头痛有关。

实验步骤
所有的研究弗林德斯大学的动物福利委员会批准。实验符合澳大利亚国家健康与医学研究理事会的科研目的的护理和使用动物的实践守则，我们将提供解释的结果，一些动物使用小心，尽量减少痛苦。

动物准备

我们用成年雄性近交系SD大鼠（350-500克），展示自发棘波放电（无主轴）（Willoughby and Mackenzie, 1992）。动物麻醉（戊巴比妥钠，60毫克/千克，IP，勃林格殷格翰，北莱德，新南威尔士州，澳大利亚）和内房颤导管和6个不锈钢螺丝表面电极植入两个电极刺激1毫米后到前囟门，侧中线，两个记录电极4.5毫米，3毫米后囟和2.5毫米，外侧，前囟门，额窦和接地电极置于枕骨在小脑前方放置在一个冷漠电极。精细绝缘银微焊接钢螺丝线焊接到插座这theelectroencephalogram脑电图（EEG）记录电缆插在动物脑内注射氟，硬膜导管在一个不锈钢的形式 钢管直径为4毫米，首次超过3毫米的孔头骨放在中心囟落后1毫米和1.5毫米的中线外侧，用骨蜡密封。电极组装，以及硬脑膜套管，内房颤导管嵌入在牙科水泥，手术后，形成了强大的headpiece.Buprenorphine（ip0.1毫克/千克）。
发作和蔓延像抑郁症事件（SDLEs）的发病率进行了测定离子敏感微电极记录（Broberg et al., unpublished observations）准备的动物。ISMS的存在改变阻抗录音的性格，所以这些动物用于测量阻抗变化幅度。

阻抗测量：理论基础
有如下体积阻抗测量的理论基础是一套行之有效的。刺激电极上的硬脑膜，颅骨固定形状限制了当前的扩散和电场是由大脑内的属性和其他结构的形成头骨。恒定电流，通过测量电极的电压是成正比的组织之间的内电场的两个等势面的阻抗上记录电极休息。一个共同组织的电阻抗模型是细胞悬浮作为一个集总电路，这种模式的电解质。代表在与电容C并联的电阻R1，在串联电阻R2，电容C和电阻R2模型细胞膜和细胞内的电解液，而电阻R1模型的抗细胞外的电解质。低频（50千赫）在我们的实验中微不足道的电流通过细胞，使阻抗值取决于在细胞外空间（(Seoane et al.,2005年）。

没有在一个复杂的空间和理论模型计算流体阻力的解析表达式只处理悬浮物的密度低，所以他们在生物组织中的精确度有限。要得到一个什么样的期待的估计，我们分裂的电流承载通路两部分;血液和脑假设已知这些分数的单元格的内容是40％）.80％，分别根据麦克斯韦 - 弗里克模型（1924年，弗里克施万凯，1965年），一阶近似产量脑组织电阻率三高血液倍。在这样的情况只从额外的电解质变化在脑组织内的细胞空间，该组织的阻抗会增加 约66％时，细胞体积增加10％。总的测量阻抗的变化将减少30％的电流通过，通过血液考虑在不同的病理过程中细胞体积的增加可能是不均匀的，但有没有手段分开不同的空间格局，除非断层技术（(Tidswellet al., 2001年）。

脑电图和阻抗录音
在这项研究中，从相同的电极记录脑电图和阻抗。所有电极，包括无动于衷，直接连接到跟随放大器（场效应管运算放大器，增益1，带宽为4 MHz），嵌在插座连接器连接到老鼠的头部。从放大器的输出进行电缆连接到记录仪。 4千赫以上的频率被送到阻抗设备和较低的频率脑电放大器分裂出去。阻抗电流还通过电缆和连接器交付。电流产生的对称恒流源提供专门用于此目的将刺激电极（以上）0.1毫安peakto-EAK。阻抗测量在50千赫。在初步研究中，我们测量发现，50千赫提供了准确的估计在很宽的频谱（1千赫至700千赫），阻抗电阻一部分。因为我们用脑电图记录A1 kHz的低通滤波器，我们录得远高于此限额的阻抗，以避免干扰。脑组织impedanceis本质上仍然是电阻在50千赫，使我们避免了脑电图录音的问题，而在同一时间获得resistiveimpedance值。
两个相同的宽带放大器测得的阻抗信号，一个信号从一个参考电阻和从测量电极等。通过相同的电流通过电阻和硬膜外刺激电极。 “电阻两端的电压为校准信号振幅和相位参考。我们不断验证信号参数和信号，如果意外相偏离或其他扰动发生。 “由阻抗信号和参考信号进行比较相敏检波器，提供了一个连续值比例阻抗电阻一部分。这个阻抗信号低通滤波在30 Hz和数字化，并记录使用一个Maclab。阻抗系统是由微处理器控制阻抗值也由内部数字化14位AD转换器，在两个每秒样本，提供手段获得校准值。脑电信号亦录得使用放大器的3 dB限制设置为0.1和1000赫兹Maclab。两脑电图和阻抗信号进行数字化处理率在4000每秒采样（MacLab，公元仪器，Bella Vista的新南威尔士州，澳大利亚），并存储在硬盘磁盘使用的是Macintosh的Quadra950计算机的离线分析。
我们测试表达阻抗变化的三种方法相对于前药物的基线：阻抗的绝对差异阻抗（欧姆），相对前药物的基线（％），相对阻抗曲线拐点的幅度每一个在其死亡的动物（正规化％拐点我们正在使用的正常化提供了一个公正的近似估计最大的细胞肿胀过程的基础上我们发生死亡时，即迅速的神经元和胶质细胞肿胀随后又慢的血管细胞肿胀。测量这一阶段提供了一个“正常化”的测量方法之间略有不同电极条件和动物，因此，不同的阻抗变化的敏感性。三措施表明了相同的行为。我们目前的绝对阻抗的变化，也可以使用归％，估计细胞大小的实际变化。
实验过程：
神经肌肉麻痹 继外科手术准备后，将1-7天的恢复期，动物被包裹在毛巾，四线连接到预先植入的静脉插管，和甲基东莨菪碱0.1毫克/公斤之后由琥珀（10毫克/千克）静脉注射作为动物瘫痪，人工呼吸，应用非凶神恶煞应用于吻通过软塑料管，用小动物呼吸机瘫痪维持到90分钟，需要使用的额外methylscopolamine和琥珀胆碱。神经肌肉麻痹和通风后，动物的头部被轻轻地绑在了模头支持。动物，然后连接到脑电图导线和静脉导管从录音笼退出。脑电图和阻抗，然后记录。这种非有害程序被目击和动物福利委员会批准。
进行了三组研究：在印防己毒素的急性发展（4）和红藻酸诱导（5）电图癫痫阻抗测量，并在第三个研究中，我们给予脑钠氟代柠檬酸或柠檬酸钠对照组（5例，N 3），以确定选择性星形细胞功能障碍的影响，阻抗变化

印防己毒素诱发癫痫发作诱导 录制完成后几分钟的基础阻抗和脑电图，印防己毒素（Sigma公司，圣路易斯，密苏里州，美国）2.1毫克/千克溶于10％二甲基亚砜（阿贾克斯化学品，七山，新南威尔士州，澳大利亚），0.9％的生理盐水给予静脉注射超过30秒，而不会干扰动物。在10分钟内，脑电图显示纱锭，间歇性的尖峰和最后几个电图放电具有高电压聚穗或棘慢波活动持久20-80小号。 “然后杀死动物用戊巴比妥（100毫克/公斤IV）。诱导红藻氨酸致痫：海人酸（Sigma公司）10毫克/毫升溶解于10％的二甲基亚砜（阿贾克斯化学），在0.9％的盐水剂量10毫克/千克注入了30秒。从注射后10分钟左右，脑电图显示几个品种的高电压电图放电高压聚穗或棘波活动的尖峰或运行持久20-120秒。 60分钟后，处死动物巴比妥（100毫克/千克静脉注射）。氟代管理：神经肌肉麻痹和通风，硬脑膜暴露通过硬脑膜套管。一个放在硬膜利多卡因下降然后被削减。钠氟代（Sigma公司;0.8 nmol在125 NL生理盐水），准备在保尔森等人所述。 （1987年），是然后注入1.2毫米以下的大脑通过玻璃微面。阻抗和脑电图记录，直到有被排出特点是高电压尖峰和波活动，或H1.5前动物用戊巴比妥（100毫克/公斤IV）被杀害。
频谱分析
每只大鼠1分钟控制段（脑电图背景）被选中当动物瘫痪和呼吸之前给予任何印防己毒素，红藻氨酸或氟代。这部分被用于与所有后续的脑电图比较。脑电信号的频谱含量测定使用Matlab软件（Mathworks公司，Natick郡，马，美国）编写的程序。整个实验记录进行了分析，半重叠1.024小号时代，由海明光谱的窗口和快速傅里叶变换的加权。光谱（1-200赫兹）分别为
作为响应段的比例控制段表示，所谓的相对响应，灰度编码（一到20倍），并印作为压缩谱阵（频谱）。频谱图与脑电图定义在阻抗录制脑电图事件一起使用。定量脑电功率变化的背景下，我们比较了1分钟的片段在实验后期细分控制，避免急性发作或SDLEs的影响。

统计比较
方差分析Dunnett的测试的意义0.05使用SSP水平，手段和对照组（柠檬酸）之间的差异进行比较。
结果
正常化的阻抗变化
在每一个研究的结论，动物被打死巴比妥，其中取消了脑电活动，引起了阻抗过快上涨势头，最初的几个线性分钟，然后压扁长时间不完全记录。这条曲线的拐点（平均17.9基线阻抗2欧姆以上，N 16动物）在每个动物正常化阻抗测量大鼠之间。结果是，因此表示既作为绝对阻抗变化和标准化值（见表1）。之间的Pearson相关绝对阻抗拐点绝对基准阻抗为0.991（P <0.01），说明两个值之间的紧张关系，一致拐点提出的物理模型点归一化法。

控制研究 仅在神经肌肉麻痹，有阻抗没有变化。低功耗伽玛范围EEGactivity的广泛频段，可在检测30-60分钟的课程。生产柠檬酸政府在基础脑电功率谱类似的变化，动物参展狭窄或宽带伽玛活动持续小幅增加。一个简短的尖峰或不锋利的波阻抗的变化来说，柠檬酸控制于一体的动物注射后观察10分钟。瞬态阻抗上升，假定SDLEs，有时观察到微管插入后不久。柠檬酸处理动物的阻抗保持不变，在1小时（见表1）。