Wesern-bloing蛋白免疫印迹实验ppt课件.pptx

蛋白免疫印迹（Western Blot）生物实验培训系列之三生物实验培训系列之三 WB的基础一一目目 录录2 实验步骤与结果分析三三 实验室常见问题解答四四 试剂与设备二二目 录31.WB的概念2.WB的应用3.WB的原理4.WB的特点 WB的基础一一 实验步骤与结果分析三三 实验室常见问题解答四四 试剂与设备二二1.1 蛋白免疫印迹的概念是将电泳分离后的总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。41.2 蛋白免疫印迹的应用基因在蛋白水平的表达研究例：例：吴德平吴德平,王颖等王颖等.立氏立克次体蛋白抗原基因的表达和重组蛋白抗原立氏立克次体蛋白抗原基因的表达和重组蛋白抗原 的免疫印迹分析的免疫印迹分析JJ.中国人兽共患病学报中国人兽共患病学报,2009,2009,2525(1010):931-934931-934.抗体活性检测例：胡纪文，马东礼例：胡纪文，马东礼.免疫印迹法检测血清幽门螺杆菌抗体的应用价值免疫印迹法检测血清幽门螺杆菌抗体的应用价值JJ.热带医学杂志热带医学杂志,2013,2013,1313(8 8):952-956952-956.疾病早期诊断例：诸延慧，容瓘等例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术酶联免疫印迹术(EITB)(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期在小鼠日本血吸虫感染早期 诊断中的应用诊断中的应用JJ中国人兽共患病杂志中国人兽共患病杂志,1993,1993,9 9(3 3):26:26-29-29.51.2 蛋白免疫印迹的应用检测样品中特异性蛋白质是否存在例：李桂波例：李桂波.利用免疫印迹法钓取利用免疫印迹法钓取PC3MPC3M细胞中与人前列腺癌高转移细胞中与人前列腺癌高转移相关特异性短肽结合蛋白的研究相关特异性短肽结合蛋白的研究DD.吉林吉林:吉林大学吉林大学,2007.,2007.对特异性蛋白质进行半定量分析例：例：61.3 WB的原理WB采用的是聚丙烯酰氨凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白质进行着色。通过分析着色的位置和着色的深度获得特定的蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。71.4 WB的特点WB是在蛋白质电泳分离和抗原、抗体检测基础上发展起来的检测蛋白质的技术SDS-PAGE凝胶电泳：高分辨率抗原抗体反应：特异性转膜：灵敏度8目 录91.试剂2.耗材3.设备 WB的基础一一 实验步骤与结果分析三三 实验室常见问题解答四四 试剂与设备二二2.1 试剂u甲叉双丙烯酰胺uTrisHCLuSDS10丙烯酰胺u过硫酸铵uTEMED2.1 试剂11RIPA裂解液uSDS-PAGE loading Bufferu封闭液uECL显影液2.1 试剂122.1 试剂配置聚丙烯酰胺储存液：29g丙稀酰胺、1gNN-亚甲叉双丙稀酰胺、加 H2O至 100mL。注意事项:应以温热的去离子水配制储于棕色瓶，4避光保存。严格核实pH不得超过7.0，因光催化或碱催化可以发生脱氨基反应。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。132.1 试剂配置分离胶缓冲液(1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48mL1mol/LHCL 混合加水稀释到100mL终体积。浓缩胶缓冲液(0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mLH2O中，用约48mL1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100mL终体积。注意事项:过滤后4保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节pH值，而不用 Tris-HCL。转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS，并加入200mL甲醇，加水至总量1L。142.1 试剂配置SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液:pH6.8的0.5mol/LTris缓冲液8mL，甘油6.4mL，10%SDS 12.8mL，巯基乙醇3.2mL，0.05%溴酚蓝1.6mL，H2O32mL混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，沸水煮3min，混匀后再上样，一般为 20-25L，总蛋白量100g。Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LNaCl。Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000mL，临用前稀释 10 倍。152.2 耗材移液枪/枪头滤纸蓝盖玻璃瓶量筒容量瓶u离心管u烧杯u96孔板uPVDF 膜u海绵垫162.3 设备u垂直电泳仪u化学发光成像系统u台式离心机172.3 设备u高压灭菌锅u电子天平u电热恒温鼓风干燥箱182.3 设备u磁力搅拌器u4、-20冰箱19目 录201.实验步骤2.结果分析3.注意事项 WB的基础一一 实验步骤与结果分析三三 实验室常见问题解答四四 试剂与设备二二3.1 实验步骤蛋白样品制备蛋白含量测定213.1.1 蛋白样品制备在六孔板中，按照一个孔添加150L的比例添加适量RIPA裂解液，用枪吹打均匀以充分接触细胞。样品放置冰上30min（中间混匀5-6次）直至裂解完全。充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作22裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入150L裂解液，若细胞密度非常高可以适当加大裂解液用量至200L或250L。a).配制BCA工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂A,1体积试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀。b).将标准品、待测样品和工作液按下表加入到96孔板中，混匀。23管号试剂(L)空白管标准管测定管213233x3435363蛋白质标准液(1mg/mL)01246810蒸馏水(L)10986420待测样(L)10BCA工作液(L)200200 200 200200200 2002003.1.2 蛋白含量测定3.1.2 蛋白含量测定c).混匀后，在37烘箱中温浴30min，冷却至室温。d).酶标仪562nm波长下测定吸光度。e).以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。f).用测定孔平均光吸收值在标准曲线上查出相应的蛋白质含量。243.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同分子之间原有的电荷差异。25上样缓冲液的作用SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构在强还原剂（-巯基乙醇）作用下，使半胱氨酸之间的二硫键断裂蛋白质(SDS-蛋白质复合物)-3.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳PAGE胶的聚合原理：甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸铵的作用下聚合，形成胶。分子分子筛筛效效应应26清洗玻璃板配胶上样电泳停止电泳27玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板3/4位置时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拨出。（插梳子时要使梳子保持水平。）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）3.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳清洗玻璃板配胶上样电泳停止电泳28测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100水中煮5min使蛋白变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4。加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。）3.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳清洗玻璃板配胶上样电泳停止电泳浓缩胶80V电压跑20分钟，可多跑几分钟；分离胶180V电压跑至底端。纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在Marker下方切角做标记，将胶泡在清水中。293.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳3.1.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳30清洗玻璃板配胶上样电泳停止电泳3.1.4 转膜剪PVDF膜，并提前切个角，甲醇中泡约30秒，在放入蒸馏水中2min。将膜、海绵、滤纸一起泡入1*转膜液中，平衡至少5min。（转膜液可回收）打开电转印夹，在黑色面一次放入海绵垫、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵垫31转膜条件：45V，1.5h3.1.5 封闭u用1TBS漂洗一次。加入封闭缓冲液,置于振荡培养箱中进行封闭(26,80rpm/min,2-4h)。323.1.6 一抗杂交u弃封闭液，加入用Western一抗稀释液稀释的一抗杂交溶液,置于4杂交过夜或在振荡培养箱中进行杂交(26,80rpm/min,1h)333.1.7 二抗杂交u回收一抗杂交液，用TBST洗膜3次(置于振荡培养箱中,26,80rpm/min,10min/每次)u弃TBST，加入用封闭缓冲液稀释的二抗杂交溶液置于振荡培养箱中进行杂交(26,80rpm/min,1h);34WB显色的分类放射自显影底物化学发光ECL底物荧光ECF底物呈色DAB35放射自显影原理：利用放射性核素发射的射线，使感光材料中的卤化银等感光，显出影像后进行放射性标记物的定位和定量测量的技术。特点：灵敏度高、分辨率好、保存时间长久，但由于实验所用方式性物质对人体有辐射作用。应用：多用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。底物化学发光ECL原理:化学发光是在一些特殊的化学反应中吸收了反应释放的化学能,而处于电子激发态的反应中间体或反应产物由激发态回到基态时所产生的一种光辐射化学发光分析是根据化学反应产物的光辐射(化学发光)确定物质含量的一种痕量分析方法。特点:灵敏度高和线性范围宽，不需要任何光源。底物荧光ECF原理：是利用的荧光染料（如Cy2,Cy3,Cy5）标记二抗，标记荧光染料的二抗分别对应相应的目的蛋白，以此实现通过检测荧光染料的信号强度，实现种蛋白信号的检测，以进行精确的定量分析。荧光检测Western Blot本来不是检测的主流方法，不过荧光法检测允许在同一张转印膜上用不同颜色的荧光底物同时检测不同的目标。底物DAB呈色原理：二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）是辣根过氧化物酶最敏感、最常用的显色底物，反应产物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被广泛地用于蛋白印迹（Western Blot,WB)、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)和免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)、斑点印迹(Dot blot)和生物芯片(Biochip)等的染色和显色反应。用之进行对底物显色即被称为底物DAB呈色法。此技术成本低，操作也较简单是常用的western blot成像分析技术之一，不过由于其灵敏度稍低，在目的蛋白表达量较少的情况下可能没有理想的结果应慎用。3.1.8 显影检测弃二抗溶液，用TBST洗膜3次（置于振荡培养箱中，26，80rpm/min,10min/每次）；ECL工作液的配制：等体积混合Detection reagent 1和Detection reagent 2，现配现用。根据膜的大小，按每10平方厘米膜加1mL ECL工作液，滴加ECL工作液工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，放置1分钟。利用化学发光系统采集图像和进行图像分析。403.2 结果分析413.3 注意事项42电泳结束后，应及时用清洗干净玻璃板，清洗时应使用海绵擦布，切勿使用刷子，以免刮花玻璃板；并及时冲洗电泳槽，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀；注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的叠放位置，以保证正确的转印方向；注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的相对大小，以免造成短路；转印结束后，应及时取出转印膜，并立即用TBST漂洗1-2遍，并立即加入封闭液，这样可以避免膜上的杂质残留或膜变干导致背景高的问题；WB的基础一一目目 录录43 实验步骤与结果分析三三 实验室常见问题解答四四 试剂与设备二二常见问题解答没信号膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品也无条带：实验失败？抗体失效？重新进行实验，重新稀释抗体；膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品有条带：实验样品降解？实验样品无该蛋白的表达？转膜效率过低？重新进行实验，复核查找上述原因，以寻找对策。背景过高目的条带以外的区域有信号，如果是片状，甚至整块膜，一般是封闭不好，膜变干，一抗非特异杂交或二抗的非特异杂交导致；如果是条纹状，一般是由于膜上有压痕导致，如果是点状，一般是膜上有杂质，或泡膜时膜没有充分浸泡；转膜效率过低。44常见问题解答一抗效价低：提高一抗稀释比例，提高杂交时间，减少洗膜次数，提高曝光时间，提高上样量；转膜效率低：检测转膜试剂和耗材，优化转膜条件；在目的带以外的信号条带为杂带，一般由于一抗的特异性不好所导致，如果目的带比杂带信号强，可通过减低一抗的稀释比例，并缩短杂交时间解决；如果目的带比杂带信号弱，在不减低一抗的稀释比例的前提下，缩短杂交时间；并提高TBST缓冲液的NaCl的浓度提高到500nM；杂带如果与目的带的位置相距较远，可以不优化实验，直接裁剪即可，杂带如果与目的带的位置相距较进，应调整胶浓度，并延长电泳时间。有杂带目的带弱45两块玻璃板两块玻璃板之间灌胶之间灌胶,胶为什么总是不平胶为什么总是不平?46玻璃未洗净过硫酸铵和TEMED加量过多可导致胶凝固过快而使胶不平加入试剂后未摇匀，导致局部聚合剂浓度过高，聚合较快而使胶不平加入不均匀，应注意手法灌胶后应进行压胶(可用水或正丁醇)温度会影响胶聚合，若受热不均匀，也会影响胶聚合不均匀。为什么会有为什么会有“微笑微笑”和和“倒微笑倒微笑”这样的效果呢？这样的效果呢？47 微笑是因为灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂直电泳时常常发生。“倒微笑“也称“皱眉”现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象；中间部分和两端受热不一样而致成了“倒微笑”可能是因为两端的胶凝的不好，加APS和TEMED后应该混合均匀。Western-blotWestern-blot制胶时好多泡泡怎么办制胶时好多泡泡怎么办？48玻璃板需用洗洁精洗后再用双蒸水冲洗，晾干配胶时应沿管壁缓缓加入各成分，用手轻轻摇匀；若用枪头吹打需缓慢且不要打到头倒胶时，用枪沿一侧缓缓加入，不要打到底，以免带入气泡封胶时，可用200L枪加水，减小压力，以免把胶冲起室温制胶时，由于温差及凝胶聚合反应放热可产生气泡分离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，迅速插梳子49WB标准实验-试剂耗材与设试剂耗材与设备备试剂：uSDSuRIPA裂解液u丙烯酰胺u甲叉双丙烯酰胺uTEMEDuECL显影液u封闭液uTrisHCLu过硫酸铵uSDS-PAGE loading Buffer50耗材：u离心管u烧杯u96孔板uPVDF 膜u海绵垫u移液枪/枪头u滤纸u蓝盖玻璃瓶u量筒u容量瓶设备：u台式离心机u化学发光成像系统u垂直电泳仪u电热恒温鼓风干燥箱u电子天平u高压灭菌锅u磁力搅拌器u4、-20冰箱WB标准实验-试剂配置试剂配置聚丙烯酰胺储存液：29g丙稀酰胺、1gN,N-亚甲叉双丙稀酰胺、加 H2O至 100ml。分离胶缓冲液(1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48mL1mol/LHCL 混合加水稀释到100mL终体积。浓缩胶缓冲液(0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mLH2O中，用约48mL1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100mL终体积。转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS，并加入200mL 甲醇，加水至总量 1L。51SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液:pH6.8的0.5mol/LTris缓冲液8mL，甘油6.4mL，10%SDS 12.8mL，巯基乙醇3.2mL，0.05%溴酚蓝1.6mL，H2O32mL混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，沸水煮3min，混匀后再上样，一般为 20-25L，总蛋白量100g。Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LNaCl。10 xTris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000mL。临用前稀释 10 倍。52WB标准实验-试剂配试剂配置置WB标准实验流程在六孔板中，按照一个孔添加150L的比例添加适量RIPA裂解液，用枪吹打均匀以充分接触细胞。样品放置冰上30min（中间混匀5-6次）直至裂解完全。充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作53WB标准实验流程54管号试剂(L)空白管标准管测定管213233x3435363蛋白质标准液(1mg/ml)01246810蒸馏水(L)10986420待测样(L)10BCA工作液(L)200200200200200200200200配制BCA工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂A,1体积试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀。将标准品、待测样品和工作液按表1加入到96孔板中，混匀。在37烘箱中温浴30min，冷却至室温。酶标仪562nm波长下测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。用测定孔平均光吸收值在标准曲线上查出相应的蛋白质含量清洗玻璃板配胶上样电泳玻璃板对齐放入夹中卡紧，垂直卡在架子上准备灌胶配分离胶，加入TEMED立即摇匀即可灌胶。待胶面升到玻璃板3/4位置，胶上加一层水，液封后胶凝的更快。（加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。配浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。（插梳子时要使梳子保持水平）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。适量蛋白加入4：15*Loading Buffer于离心管，100水中煮5min使蛋白变性。放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4。加足够的1*电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。）停止电泳浓缩胶80V电压跑20分钟，可多跑几分钟；分离胶180V电压跑至底端。纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在Marker下方切角做标记，将胶泡在清水中。55WB标准实验流程ComponentVolumeddH2O3.3ml30%丙烯酰胺溶液4.0 mlTris-HCl(1.5M,pH8.8)2.5ml10%SDS0.1ml10%AP0.1mlTEMED0.004mlTotal10ml12%分离胶配方ComponentVolumeddH2O2.7ml30%丙烯酰胺溶液0.67 mlTris-HCl(1.0M,pH6.8)0.5ml10%SDS0.04 ml10%AP0.04 mlTEMED0.004 mlTotal4.0ml5%浓缩胶配方WB标准实验流程56剪PVDF膜，并提前切个角甲醇中泡约30秒，在放入蒸馏水中2min。将膜、海绵、滤纸一起泡入1*转膜液中，平衡至少5min。（转膜液可回收。）打开电转印夹，在黑色面一次放入海绵垫、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵垫57WB标准实验流程用1TBS漂洗一次。加入封闭缓冲液,置于振荡培养箱中进行封闭(26,80rpm/min,2-4h)。弃封闭液，加入用Western一抗稀释液稀释的一抗杂交溶液,置于4杂交过夜或在振荡培养箱中进行杂交(26,80rpm/min,1h)转膜条件：45V，1.5h58WB标准实验流程回收一抗杂交液，用TBST洗膜3次(置于振荡培养箱中，26，80rpm/min，10min/每次)弃TBST，加入用封闭缓冲液稀释的二抗杂交溶液,置于振荡培养箱中进行杂交(26，80rpm/min，1h)弃二抗溶液，用TBST洗膜3次（置于振荡培养箱中，26，80rpm/min,10min/每次）；ECL工作液的配制：等体积混合Detection reagent 1和Detection reagent 2现配现用。根据膜的大小，按每10平方厘米膜加1ml ECL工作液，滴加ECL工作液工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，放置1分钟。利用化学发光系统采集图像和进行图像分析。59