高效液相色谱仪常见故障处理.doc

高效液相色谱仪常见故障处理
中国色谱网(2010-11-8 17:38:54)   

　　来源：上海市计算技术研究所-色谱仪器事业部
    LC-10AT高效液相色谱仪是日本岛津公司1996年的产品，检测器为可变波长紫外检测器，色谱柱为岛津公司的ODS-C18，大连依利特的ODS-C18。
　　八年的日常工作中遇到了几种故障，如故障1经咨询岛津公司的工程师后，得以解决；故障2、故障5是频繁碰到的问题等，特作总结如下：
　　故障1流动相内有气泡，关闭泵，打开泄压阀，打开purge键，清洗脱气，气泡不断从过滤器冒出，进入流动相，无论打开purge键几次，都无法清除不断产生的气泡
　　原因过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内，过滤器内部由于霉菌的生长繁殖，形成菌团，阻塞了过滤器，缓冲液难以流畅地通过过滤器，空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。
　　处理过滤器浸泡于5%硝酸溶液中，超声清洗几分钟即可；亦可将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中12～36小时，轻轻震荡几次，再将过滤器用纯水清洗几次，打开泄压阀，打开purge键，清洗脱气，如仍有气泡不断从过滤器冒出，继续将过滤器浸泡于5%硝酸溶液中，如没有气泡不断从过滤器中冒出，说明过滤器内部的霉菌菌团已被硝酸破坏，流动相可以流畅地通过过滤器。打开泄压阀，打开泵，流速调至1.0～3.0ml/min，纯水冲洗过滤器1小时左右。即可将过滤器清洗干净。关闭泄压阀，纯甲醇冲洗半小时即可。
　　故障2柱压高原因(1)缓冲液盐分如(乙酸铵等)沉积于柱内；(2)样品污染沉积。
　　处理对于第一种情况先用40～50℃的纯水，低速正向冲洗柱子，待柱压逐渐下降后，相应提高流速冲洗，柱压大幅度下降后，用常温纯水冲洗，之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟；对于第二种情况，由样品的沉积引起污染的C18柱，和纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定)，再用换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。
　　故障3既无压力指示，又无液体流过[1>。
　　原因(1)泵密封垫圈磨损；(2)大量气泡进入泵体。
　　处理对于第一种情况，更换密封垫圈；对于第二种情况，在泵作用的同时，用一个50ml的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。
　　故障4压力波动大，流量不稳定.
　　原因系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物，使得两者不能密封。
　　处理工作中注意观察流动相的量，保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底，避免吸入空气，流动相要充分脱气[2>。如为单向阀和阀座之间夹有异物，拆下单向阀，放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗.
　　故障5出峰不佳，峰分叉。
　　原因(1)色谱柱被污染；(2)柱头填料塌陷。
　　处理对于第一种情况，先用纯水反向冲洗柱子，然后换成甲醇冲洗，接着用甲醇+异丙醇(4+6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定)，再换成甲醇冲洗，然后用纯水冲洗，最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。如冲洗后依然出峰不佳，则考虑第二种情况。对于第二种情况，拧开柱头，检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分(污染的填料)，装入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷，再填，用与柱内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧，再填平，滴甲醇，再压紧反复几次，直至装满填平[2>。柱头用甲醇冲洗干净，擦净柱外壁的填料，拧紧柱头，用纯甲醇冲洗30分钟以上。
　　故障6峰面积重复性不佳。
　　原因(1)进样阀漏液；(2)加样针不到位。
　　处理对于第一种情况更换进样阀垫圈；对于第二种情况保证加样针插到底，注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD状态转换到INJECT状态，以保证进样量的准确。日常工作中，液相色谱仪的保养非常重要，如要注意不要让空气进入输液系统和高压泵中，储液器内的溶液如长时间未用应清洗储液器并更换溶液，每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净，防止无机盐析出或沉积；样品的前处理也很重要，任何样品都要尽可能地去除杂质，完全溶解，尽量减少对色谱柱的污染，以延长色谱柱的使用寿命，同时避免注射过浓的样品溶液，以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞；色谱柱作好标记，用于不同分析目。

色谱仪的日常维护
中国色谱网(2010-11-2 17:03:34)   

　　　　来源：山东金普分析仪器有限公司
    1、日常维护
　　1.1泵
　　泵是液相色谱仪的心脏，须精心维护和保养。处于良好工作状态的泵，其基线平稳，保留时间重现性好，梯度洗脱时压力变化缓慢而平稳。要使泵具备良好的操作性能，应该保持泵系统的洁净。具体做法如下：
　　（1）要选择优质的溶剂和试剂，在进入仪器前用0.45um膜过滤，并进行脱气处理。
　　（2）泵开始使用时，一定要对其排气数分钟；使用完毕，要用流动相清洗泵和色谱柱约30分钟；如果使用了缓冲溶液，一定要用合适的流动相彻底清洗干净。
　　（3）定期检查并更换在线过滤片及有关的垫圈，并经常清洗进液处的微孔过滤头。
　　（4）改变流动相时，应避免沉淀产生，以防止泵堵塞。
　　1.2色谱柱
　　色谱柱是化合物分离的关键。保养良好的色谱柱应具有很高的塔板数，且仪器基线平稳。色谱柱比较娇气，在平时的工作中须注意以下事项：
　　（1）色谱柱不能够碰撞、弯曲或强烈震动；安装时，一定要保证阀件或管路的清洁。
　　（2）流动相在使用前必须进行脱气处理，尽量不使用或少使用高粘度流动相。
　　（3）在满足灵敏度的情况下，尽可能使用小进样量。如果样品比较“脏”，要进行净化或提纯处理。
　　（4）分析结束后，要清洗掉进样阀中残留的样品，并用流动相或适当的溶剂清洗色谱柱。
　　（5）如色谱柱长期不用，应该用适当的有机溶剂保存并封闭或长期给柱子补充合适的流动相。
　　1.3检测器
　　对于紫外检测器，在分析前，柱平衡得差不多时，开启检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。
　　1.4进样器
　　分析结束后，应反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染或堵塞。
　　2、常见故障的分析与排除
　　即使日常精心维护的液相色谱仪，随着使用时间的增加或使用者经验的不足也会出现一些问题或故障。现将液相色谱仪容易出现的故障及解决办法介绍如下：
　　2.1保留时间变化
　　保留时间的变化有三种情况：波动、缩短、延长。
　　保留时间出现波动时，应检查柱温是否处于恒温状态，如果设置为室温，气温的变化会引起保留时间的波动，应该设置为恒定温度；等度和梯度间还没有充分达到平衡状态时，应该用十倍以上柱体积的流动相去平衡色谱柱；缓冲液浓度太低时，应换用>25mmol/L的缓冲液；色谱柱被污染或已接近柱寿命时，应更换保护柱或换新色谱柱。
　　保留时间缩短时，流速增加，应检查流速的设定；柱温高时，应检查柱温的设置；进样量太大时，减少样品用量或降低样品浓度；流动相的组成发生了改变，比如流动相中易挥发性有机相蒸发，两相之间互溶不好，会导致流动相不均匀或某一相出现部分沉淀；流动相的pH值应保持在3-7.5范围内，否则回引起柱键合相的流失。
　　保留时间延长时，流速减小，应检查流速的设定和管路是否有泄露；柱温低时，检查柱温的设置；流动相的组成发生了改变，比如流动相中易挥发有机相蒸发，两相之间互溶不好，会导致流动相不均匀或某一相出现部分沉淀；检查流动相的pH是否在3-7.5范围内，否则会引起柱键合相的流失。
　　2.2峰拖尾
　　色谱柱超载时，要减少进样量或稀释样品或使用高容量的色谱柱；色谱柱性能不佳时，更换色谱柱；死体积或柱外体积过大时，将连接点降至最低，并对所有连接点作合理的调整，尽可能采用细内径的连接；加入硅羟基，其作用是钝化色谱柱，增加缓冲液的浓度，降低流动相的pH值，钝化样品；出现峰干扰时，应清洁样品，调整流动相。
　　2.3峰展宽
　　进样体积过大时，用流动相配样；样品过载时，进小浓度、小体积样品；在进样阀中造成峰扩展时，进样前后排出气泡，以降低扩散；流动相粘度过高时，提高柱温，并采用低粘度流动相；等度洗脱，保留时间过长时，要增加流速或改用梯度洗脱；柱外体积过大时，将连接管径和连接管长度降至最小[1]。
　　2.4基线噪声
　　流动相或检测器中有气泡时，要对流动相进行脱气处理；检测器灯有连续噪声时，更换氘灯；出现由污染引起的随机噪声时，应清洗色谱柱、净化样品、使用HPLC级试剂；偶然有噪声时，可能是来自电源的干扰，如果电压不稳时，应采用稳压电源。
　　2.5肩峰或分叉
　　进样量太大或样品浓度过高时，要减少进样量或稀释样品；样品溶剂太强时，应使用软弱的样品溶剂；色谱柱性能欠佳时，应更换色谱柱。
　　2.6鬼峰
　　色谱柱未达到平衡时，要继续平衡色谱柱；样品中溶剂出峰时，使用流动相作样品的溶剂；出现进样阀余峰时，使用强溶剂清洗进样阀，并改进阀和样品的清洗程序；流动相用水不合格，应使用HPLC级的水。
　　3、使用注意事项
　　在使用混合溶剂作流动相时，一定要先混合，再过0.45um滤膜；等流动相恢复至室温，用超声波或He气进行脱气处理后，方可使用。
　　更换流动相时，必须按一定的程序进行，否则会产生问题。更换流动相有三种情况：互溶性流动相的更换、无互溶性流动相的更换和缓冲溶液的更换。对于第一种情况，先用准备更换的流动相把吸滤器完全清洗，再打开仪器的排液阀，按清洗键，清洗泵中的流动相。将吸滤器放入新流动相中，减慢流速清洗数分钟后关闭排液阀。接下来清洗色谱柱和检测器检测池直到基线平稳。对于第二种情况，先用与新旧流动相都互溶的中间清洗液（如：异丙醇）清洗，再用新流动相清洗，具体过程与第一种情况相同。对于第三种情况，应先用蒸馏水作为中间清洗液进行清洗，再用新流动相清洗即可。

高效液相色谱梯度洗脱时应该注意的问题
中国色谱网(2010-11-2 17:01:14)   

　　来源：山东金普分析仪器有限公司
　　在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此必然带来一些特殊的问题，我们必须充分地重视。
　　1、要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸铵（pH5.16）做梯度洗脱，乙腈含量超过70%时就会出现不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%时就会分层等。当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。
　　2、梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辩认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头上后会被强的溶剂洗脱出来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止溶剂混合时产生气泡。
　　3、混合溶剂的粘度常随组成而变化，因此在梯度洗脱时常会出现压力变化，例如纯水或甲醇的粘度都比较小，但是当二者以相近的比例混合时粘度会增大很多，此时的柱压是纯水或甲醇为流动相时的两倍。因此要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力。
　　4、每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始的状态。需让10～30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。

液相色谱柱的再生
中国色谱网(2010-11-1 16:02:15)   

　　来源：上海禾工科学仪器有限公司
　　因为色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。
　　（1）、反相柱的再生
     依次采用20-30倍的色谱柱体积的甲醇：水=10：90（V/V），乙腈，异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。
　　（2）、正相柱的再生
    依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。

安捷伦Agilent1100液相的维护
中国色谱网(2010-11-1 15:58:22)   

　　来源：上海禾工科学仪器有限公司
　　1．判断仪器脱气机是否正常：打开purge阀，流速设为2ml/min，然后提起过滤头，让体系进一些空气，再放下过滤头，看气泡是否会减少来判断脱气机是否起作用；
　　2．溶剂过滤头不可超声清洗，可用35%硝酸浸泡1小时后再用溶剂清洗；
　　3．EDTA、乙二胺四乙酸等会对液相柱的不朽钢产生腐蚀；四氯化碳与2-异丙醇、四氢呋喃不可混合使用，但可单独使用；
　　4．溶剂的使用：每两天更换或重新过滤溶剂（尤其是水，需要每天更换）；流动相过滤是为了去除微生物，一般水要放在棕色瓶中；
　　5．判断purge阀的滤芯是否需更换：用水作流动相时，流速为5ml/min时，正常泵压应为0bar（若打开purge阀时，泵压超过10bar时需更换滤芯）；
　　6．若用非极性溶剂作流动相，则需更换泵中起密封作用的“黑草帽”（适合反相的材料为石墨+聚四氟乙烯，而适合正相的为），而且必须一对同时更换，否则损坏更快；
　　7．密封垫的冲洗：当流动相中盐的浓度>0.01M时，可减少密封垫的磨损；用1%异丙醇溶液冲洗活塞杆中析出的盐（加异丙醇是为了防止细菌生长），流速设为3-5滴/min；泵开着，洗盐装置也须开着；
　　8．泵头不可用超声清洗（可用乙醇、水清洗）、宝石杆不可超声，石英窗可用超声清洗；
　　9．缓冲盐的通道放在比例阀的下面，只有两相的话，只用一边（盐在下面，有机相在上面）；
　　10．双元泵为泵后混合方式（为高压混合方式，不易进气泡），而四元泵为低压混合方式；
　　11．出口球型阀（outletballvalve）可用超声清洗；
　　12．双元泵有一个筛网（sieve）可控制低流速；
　　13．流动相使用了缓冲盐，则必为反相柱（不可长时间用水冲），一般可冲20-30min，然后加入有机相（如甲醇），浓度逐步加大，直至100%甲醇；
　　14．反相和正相转换时，一般要做溶剂过渡（最佳为异丙醇），因为粘度大，流速不可设太大，不要超过1ml/min（完全置换原来溶剂所需溶剂体积=体系体积（柱体积+1.5ml）×5）；
　　15．比例阀内漏：抬起有嫌疑的通路，看管内流动相体积是否减少（抬起时同时打开purge阀）；
　　16．泵压力不正常可能原因：气泡、主动阀故障、出口阀故障、密封垫或柱塞杆磨损，渗漏或堵塞、比例阀故障、传感器故障、使用比例阀混合时盐浓度太高；
　　17．自动进样：旁路状态、主路状态；手动进样：load状态至inject状态（最好满刻度进样，建议吸3倍以上进样体积），小体积进样则以小于1/2进样阀体积为佳；平时进样阀最好保持在inject状态（最右边状态）；
　　18．进样流程：插针——inject状态——load状态——进样（缓慢）——inject状态——拔出针（进样阀后有两根废液管）；
　　19．VWD（可变波长）检测器：检测器后out废液管不可太短，否则流通池容易进气泡，也不可太长，否则易压碎流通池；
　　20．DAD检测器（优势为优化条件方便）：最大波长选择——要选择溶剂没有吸收的位置（避开约20nm）；VWD检测器的灵敏度略高于DAD检测器；滤光片中钬玻璃用于校准波长；若要检测器的灵敏度提高则要开大狭缝（二极管阵列前狭缝默认为4nm）；
　　21．DAD检测器的氘灯可用于VWD检测器，但反之则不行；钨灯、氙灯寿命长，可随开随用，但“氘灯需要预热（10几分钟）（寿命为1000小时），1-2小时不用，不用关，还是开着更好，氘灯放时间长容易衰变”，灯可进行测试；
　　22．测定条件设定：referencewave（流动相中溶剂的吸收）可以不设，梯度洗脱时参考波长要设，否则会导致基线漂移，DAD可选一个样品没吸收的波长作为参考光；bandwidth（VWD设为光谱的半谱带宽度，而DAD检测器则不用设）（此范围内作色谱图可降低噪音，信噪比更好，但信号会降低）；参考波长选择原则：样品没有吸收，但靠近样品最大吸收的位置；参考光波长带宽必须大于或等于测量光波长带宽；DAD选条件时要存所有光谱图（spectrum）；氘灯（190-800nm），但有效范围为190-600nm，钨灯（470-950nm），若用470-800nm时两灯同开则强度加大；
　　23．基线噪音大原因：泵压不稳、有气泡、柱污染
　　24．清洗在线脱气机及比例阀（尤其是长期使用水相或缓冲盐的通路）：先用水冲洗，再用甲醇冲洗，可以打开purge阀，使用5ml/min的流速，也可用IPA清洗：A、BufferB、MeoHC、WaterD、CH3CN分析：A:B:D=20:
　　25．流动相pH>9.5或<2.3时，进样阀应更换tefzel转子密封，可耐受压：VWD(40bar)，MWD(120bar),FLD(20bar),RID(56bar)；RID,FLD永远是最后一个检测器。

怎样维护液相色谱仪？
中国色谱网(2010-10-29 17:25:40)   

　　来源：上海科捷分析仪器有限公司
　　1、给色谱柱加温，温度升高的目的，部门在于增加溶质的溶解度，但更重要的是降低溶剂的黏度，从而改进峰形和分离度。C18柱的柱温一般不要超过40摄氏度，否则健合相轻易脱落的。温度升高会降低留存时间，这对分离度也有影响，温度的变化对谱带宽度的影响甚大，而塔板高度受温度的影响固然也取决于所采用的色谱类型，而温度升高老是要降低塔板高度的。
　　2、流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持不乱；泵中有气泡，可通过排气等操纵将气泡赶出；活动相分歧适，解决办法为改换活动相或使活动相在控制室内进行适当混合
　　3、进样器使用，除每次用水清洗外，隔一段时间后，最好用甲醇或乙腈反复吸取，清洗一下。
4、液相色谱中峰泛起拖尾或泛起双峰的原因是什么?筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲刷柱子，替代筛板或更换柱子；存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换活动相或更换选择性好的柱子。

关于液相维护的相关知识与经验时间
中国色谱网(2010-10-29 18:32:17)   

来源：上海科捷分析仪器有限公司
　　一、混合溶剂必须要过滤以后才能混合，万一要混合后过滤的话，只能用有机的，绝对不能用水系的。因为水系的材料是纤维素，有机相回或多或少的溶解一点纤维素的，造成污染。
　　二、标样或样品最好用流动相溶解（排除特殊情况），可以避免很多麻烦。
　　三、给色谱柱加温，温度升高的目的，部分在于增加溶质的溶解度，但更重要的是降低溶剂的黏度，从而改进峰形和分离度。注意：温度升高会降低保留时间，这对分离度也有影响，温度的变化对谱带宽度的影响甚大，而塔板高度受温度的影响虽然也取决于所采用的色谱类型，而温度升高总是要降低塔板高度的。
　　四、C18柱的柱温一般不要超过40摄氏度，否则健合相容易脱落的。
　　五、进样器使用，除每次用水清洗外，隔一段时间后，最好用甲醇或乙腈反复吸取，清洗一下。
　　六、用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在?如何解决?
　　答：关于漂移问题：
　　1、温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定
　　2、流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等
　　3、柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡
　　七、关于快速变化问题：
　　1、流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定
　　2、泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。
　　3、流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合
　　八、液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?
　　1、筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。
　　2、存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子
　　九、毛细管色谱分流进样时非线性分流的主要原因是什么?
　　1、进样器温度太低，样品汽化不完全，发生分级分流。
　　2、进样器温度太高，某些组分可能发生热分解，也有的样品可能发生催化分解，或样品部分地被吸附在进样器内表面上。
　　3、在分流点以前样品没有混合均匀或混合不充分。
　　4、系统的进样垫，柱接头等地方漏气。
　　十、做液相色谱分析时，柱压不稳定，原因何在?如何解决?
　　答：原因可能有：
　　1、泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理;
　　2、比例阀失效，更换比例阀即可。
　　3、泵密封垫损坏，更换密封垫即可。
　　4、溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法;
　　5、系统检漏，找出漏点，密封即可。
　　6、梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
　　十一、做PGS/MS分析时，如何防止焦油状污染物进入毛细柱?
　　答：聚合物，尤其是一些含氮、硫及卤素的高分子裂解时，常有焦油状物质产生。为防止这种焦油状物质进入毛细柱造成污染而使柱性能下降，可采用保护预柱，即在裂解器与毛细柱之间接一填充预柱，通过控制预柱温度而使焦油状物质滞留在预柱内，预注可置于GC气化室内，这样既容易控制温度，又减少系统的死体积，当然，预柱填料需经常更换。
　　十二、我最近更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不能重现，为什么?
　　答：这是因为被分析物可能具有形成氢健的能力。液相色谱仪尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。在流动相中加入少量竞争物，如三乙基胺（TEA），将会使硅醇基的成键能力饱和，从而保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。
　　十三、高温毛细柱的使用寿命一般为多长?
　　答：毛细柱寿命除决定于柱子本身的性能外，在很大程度上取决于使用情况，比如使用温度、样品状态，进样量等，如果在其使用温度范围内，样品干净，色谱柱不被污染的情况下，柱子寿命一般在2—3年之间。

HPLC分析方法开发中流动相的调整“秘诀”
中国色谱网(2010-10-28 16:51:55)   

　　来源：仪器网
　　秘诀1：由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。
　　秘诀2：三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。
　　秘诀3：粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。

教你几招保证柱性能与柱寿命
中国色谱网(2010-10-28 16:41:33)   

　　　　来源：仪器网
    ◆认证阅读色谱柱使用说明书；
　　◆使用填充良好的色谱柱；
　　◆尽量减少压力波动，避免机械及热冲击；
　　◆使用保护柱及在线过滤器；
　　◆经常以强溶剂冲洗色谱柱；
　　◆充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与强保留成分；
　　◆用稳定的固定相（C18最稳定）；
　　◆在中等PH值操作（6~8），用有机缓冲溶液；
　　◆色谱柱使用温度最好小于40℃；
　　◆硅胶基质的的色谱柱，应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0；
　　◆在水流动相与缓冲溶液中加200ppm的叠氮钠；
　　◆流动相中含有缓冲溶液，应注意应95∶5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不能低于5%；
　　◆过夜或贮存时，冲洗掉盐和缓冲液，用纯有机溶剂流动相保存（乙晴最好）。

Agilent液相色谱保养知识
中国色谱网(2010-10-27 16:18:38)   

　　　来源：禾工科仪
　　1、色谱柱长时间不用，存放时，柱内应充满溶剂，两端封死（如ACN适于反相色谱柱，正相色谱柱用相应的有机相）
　　2、对于手动进样器，当使用缓冲溶液时，要用水冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。
　　3、流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。
　　4、带seal-wash的1100，要配制90%水+10%异丙醇，以每分2—3滴的速度
　　虹吸排出，溶剂不能干涸。
　　5、其它主意事项见说明书，或由现场工程师介绍。
　　维护保养知识问答
　　1、为什么溶剂和样品要过滤?
　　溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。
　　色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。
　　仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。
　　样品过滤头的类型：
　　30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.2µm和0.45µm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50µl。13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.2µm和0.45µm两种规格,材料为纤维素。3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2µm和0.45µm两种规格。处理样品体积为7µl。
　　滤膜类型：
　　1.聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。
　　2.醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。
　　3.尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。
　　4.再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。
　　2、为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项？
　　HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项
　　清洗液配制:90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。以2-3滴/min的速度虹吸流下，不能干涸。
　　3、为什么Agilent1100LC的流动相管路非常细?
　　在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，Agilent1100LC使用加工工艺难度高的毛细管线作为流动相管路。
　　毛细管线分类：0.17mm内径------绿色;0.12mm内径-------红色。
　　PEEK管线：内径-----0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。
　　毛细管线优点:柔韧性好.
　　***Agilent公司同时备有1/16in的粗外径毛细管线,适用于不同习惯的用户,优点是刚性好,但柔韧性差一些。
　　4、流动相使用前为什么要脱气？
　　流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。
　　常用的脱气方法比较：
　　氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。
　　加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。
　　抽真空脱气法：易抽走有机相。
　　超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。
　　在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。
　　5、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？
　　溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=4—7）。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。
　　A：请严格执行溶剂过滤。
　　B：请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液
　　C：如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001---0.001M的叠氮化钠.
　　D:在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。
　　E：避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。
　　堵塞后的处理法方法：
　　将过滤头从组件中取下，在浓硝酸（35%）中浸泡1h，然后用二次蒸馏水冲洗干净并超声处理。
　　6、Agilent1100LC泵如何维护？
　　Agilent1100LC泵给色谱柱提供稳定、无脉动、流量准确的流动相，及时合理的维护非常重要。
　　A：流动相使用前请必须脱气、过滤。
　　B：使用缓冲盐时，要加在线Seal-wash选项。
　　C：关机前，用
　　100%的水冲洗系统20分钟，然后用有机溶剂冲洗系统10分钟（如甲醇），然后关泵，（适于反相色谱柱）。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]
　　D：及时更换PurgeValve内的过滤芯。（当打开PurgeValve时，压力高于10bar，表明过滤芯已堵）。E：使用合适的密封圈。
　　7、如何选择合适的泵头活塞密封圈？
　　泵头活塞的标准密封圈能适合于大多数应用，但使用正相溶剂（如正己烷），不适合使用标准活塞密封圈，特别是长时间使用时，需更换另一种不同的密封圈，我们建议使用聚四氟乙烯密封圈。（p/n0905-1420
　　2/pk）
　　***注意：聚四氟乙烯密封圈的压力范围为：0—200bar；建议在泵的压力限制中，将最大压力设为200bar。
　　8、使用梯度比例发时要注意那些事项？
　　当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来，通常，阀A接水相/盐溶液，D接有机溶剂，此法连接可有效使盐回落到盐溶液中，并被溶解。若颠倒过来，盐可能落在有机溶剂中，出现问题。
　　强烈建议：当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时，推荐将缓冲盐通道接在A通道上，有机溶剂通道直接接在A通道的上方D通道上；定期用水冲洗所有的通道，以除去阀口上可能出现的盐沉淀。
　　9、在线真空脱气机使用要注意那些事项？
　　一般来说，Agilent1100LC的真空脱气机无需过多维护，只需注意几个注意事项就可以了。
　　A：第一次使用，要用随仪器附带的注射器抽满脱气机腔体；更换不同类型的溶剂时，要先抽空，再抽满。
　　B：不用的通道要充满溶剂或密闭起来。
　　10、更换色谱柱时要注意什么事项?
　　在使用HPLC时,应特别注意”柱外效应”对分析结果的影响，由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~5个数量级，液体流动相的流速也比气相慢1-2个数量级。因此，样品进入色谱柱后，在柱子以外的任何死体积（进样器、柱接头、连接管、检测器）中，样品分子的扩散和滞留，都会引起色谱峰的展宽，而使柱效降低。为使柱外效应减之最小，获得理想的分析结果，仪器的流动相管路连接非常重要,一般Agilent1100LC
　　在第一次安装时,均有受过专业培训的安装工程师负责安装,各种接头会处理的非常完美。客户只需在更换色谱柱时注意接头处理就可以了，一般柱子入口接头为不锈钢卡套接头，柱子出口为不锈钢卡套接头或PEEK管线手拧街头，当完成第一次安张后，不锈钢卡套已固定死，当接不同的柱子时，要注意柱子接头处的形状和长度，否则会产生一个非常大的死体积。
　　11、手动进样阀需做那些维护，使用时要注意什么？
　　对于手动进样器，当使用缓冲溶液后，或者进浓度差异比较大的样品时要用专用工具而不是用带针头的注射器冲洗进样口，同时搬动进样阀数次，每次数毫升。
　　注意事项：
　　●安装时六通阀的5，6出口要与注射器在同一水平线上，以防止虹吸现象的发生，导致进样量的重复性变异。
　　●进样量的多少要根据定量管的LOOP体积决定。
　　当样品量少时：进样体积由注射器的进样体积决定，但最大进样体积要小于1/2loop体积。
　　当样品量较多时：进样体积由定量管的体积决定，为保证样品完全把定量管的流动相置换干净，需注射5—6倍的LOOP体积。
　　●要使用专用的液相注射器进样，绝对不可以用气相的注射器。