抑制LncRNA PANDA表达对人心脏瓣膜间质细胞钙化的改善作用及其机制.pdf

山东医药2023 年第 63 卷第 23 期抑制LncRNA PANDA表达对人心脏瓣膜间质细胞钙化的改善作用及其机制凌秋洋1，赵苗茁1，王广涛1，杨志宏2，刘叶红3，叶挺3，宗刚军31 中国人民解放军海军青岛特勤疗养中心老年病康复科，山东青岛266000；2 中国人民解放军海军第九七一医院心内科；3 中国人民解放军联勤保障部队第九四医院心内科摘要：目的观察抑制长链非编码RNA PANDA（LncRNA PANDA）表达对人心脏瓣膜间质细胞（hVICs）钙化的影响，并探讨其机制是否与核酸转录因子YA（NF-YA）、凋亡相关蛋白Bax、锚定蛋白2（Notch2）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）有关。方法将体外培养的hVICs分为三组，正常对照组加入间质细胞培养基+10%胎牛血清，培养7 d；钙化组加入钙化诱导液，培养7 d。PANDA-siRNA组加入钙化诱导液培养3 d后，采用Lipofectamine3000转染试剂盒转染PANDA-siRNA，再培养4 d。取各组分组培养7 d的细胞，采用实时荧光定量PCR法检测LncRNA PANDA相对表达量，光学显微镜观察细胞形态，Western blotting法检测NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2蛋白相对表达量，ELISA法检测细胞上清液BMP-2水平。结果PANDA-siRNA组、正常对照组、钙化组细胞LncRNA PANDA相对表达量及上清液BMP-2蛋白水平均依次升高，组间两两比较P均0.05。PANDA-siRNA组细胞结构清晰，呈条索状生长，生长稍缓慢；钙化组细胞成骨样改变，细胞聚集，呈网状结构；正常对照组细胞贴壁生长，生长迅速。与正常对照组比较，钙化组细胞NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2蛋白相对表达量均升高，PANDA-siRNA组均降低（P均0.05）。结论诱导钙化后的 hVICs LncRNA PANDA 表达升高，抑制 LncRNA PANDA 表达可减轻其成骨样改变，其机制可能与降低NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2表达有关。关键词：长链非编码RNA PANDA；核酸转录因子YA；凋亡相关蛋白；骨形态发生蛋白2；人心脏瓣膜间质细胞；瓣膜钙化；心脏瓣膜病doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.23.010 中图分类号：R542.5 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）23-0043-04Effect of inhibition of LncRNA PANDA expression on calcification of human heart valve stromal cells and its mechanismLING Qiuyang1，ZHAO Miaozhuo，WANG Guangtao，YANG Zhihong，LIU Yehong，YE Ting，ZONG Gangjun1 Department of Geriatric Rehabilitation，Qingdao Special Servicemen Recuperation Center of PLA Navy，Qingdao 266000，ChinaAbstract：Objective To observe the effect of inhibition of long non-coding RNA PANDA（LncRNA PANDA）expression on the calcification of human heart valve stromal cells（hVICs）and to investigate whether its mechanism is related to the the expression of nucleic acid transcription factor YA（NF-YA），apoptosis-related protein（Bax），anchor protein 2（Notch2），and bone morphogenic protein-2（BMP-2）.The hVICs cultured in vitro were divided into three groupsin Methods The hVICs cultured in vitro were divided into three groups：the normal control group was cultured with interstitial cell medium+10%FBS for 7 d；the calcified group was supplemented with the calcification induction solution and was cultured for 7 d；the PANDA-siRNA group was incubated for 3 d with the calcification induction solution，and then was transfected with PANDA-siRNA by Lipofectamine 3000 transfection kit and was cultured for another 4 d.Cells cultured in groups for 7 d were selected.The relative expression of LncRNA PANDA was measured by real-time fluorescent quantitative PCR，cell morphology was observed by light microscope，the relative expression levels of NF-YA，Bax，Notch2，and BMP-2 proteins were detected by Western blotting，and BMP-2 level in cell supernatant was detected by ELISA.Results The relative expression levels of LncRNA PANDA and BMP-2 protein in the PANDA-siRNA group，normal control group，and calcified group increased successively，with statistically significant difference between groups（all P0.05）.The cells 基金项目：江苏省自然科学基金资助项目（BK20201139）。通信作者：宗刚军（E-mail：）开放科学（资源服务）标识码（OSID）43山东医药2023 年第 63 卷第 23 期in the PANDA-siRNA group had clear cell structure with cord-like growth and slightly slow growth，the cells in the calcified group had osteogenic changes with cell aggregation and network structure，and the cells in the normal control group grew adhering to the wall and grew rapidly.Compared with the normal control group，the relative protein expression levels of NF-YA，Bax，Notch2 and BMP-2 all increased in the calcified group，and decreased in the PANDA-siRNA group（all P0.05）.Conclusion LncRNA PANDA expression increases in hVICs after induction of calcification，and inhibition of LncRNA PANDA expression attenuates its osteogenic-like changes，and its mechanism may be related to decreasing the expression of NF-YA，Bax，Notch2，and BMP-2.Key words：long non-coding RNA PANDA；nucleic acid transcription factor YA；Bax；bone morphogenic protein 2；heart valve stromal cells；valve calcification；valvular heart disease随着人口老龄化进程加快，我国已成为心脏瓣膜病高发国家，据统计我国现有心脏瓣膜病患者约2 500 万1。实验研究表明，心脏瓣膜钙化为主动性、进行性过程，与细胞凋亡、细胞基质改变、细胞炎症反应等密不可分2。长链非编码RNA（LncRNA）是一类缺少蛋白质编码功能的 RNA，位于细胞核内，长度超过200 bp，自身无开放阅读框架，具有一定的保守性3。LncRNA虽然不编码蛋白质，但在生物体内参与组蛋白修饰、基因沉默、转录调节，与肿瘤的发生密切相关。LncRNA还参与调控细胞钙化与炎症反应，与心血管疾病的发生与发展密不可分4。LncRNA PANDA 是一种转录因子，位于 CDKN1A基因转录起始位点上游约5 kb处，可直接诱发细胞凋亡与细胞炎症反应的发生 5。2022年3月12月，本研究探讨了抑制LncRNA PANDA表达对人心脏瓣膜间质细胞（hVICs）钙化及细胞凋亡、炎症反应相关因子的影响，为探讨心脏瓣膜钙化的相关机制及其治疗提供新的方向。现报告如下。1 材料与方法 1.1材料细胞：hVICs购自美国DV公司。主要试剂：间质细胞培养基购自美国DV公司，-甘油磷酸、L-抗坏血酸、地塞米松、重组碱性磷酸酶均购自美国Sigma公司，核酸转录因子YA（NF-YA）、凋亡相关蛋白Bax、锚定蛋白2（Notch2）、骨形态发生蛋白2（BMP-2）检测试剂盒均购自英国Abcam公司，BMP-2蛋白检测ELISA试剂盒购自美国R&D公司，TRIzol试剂、逆转录试剂盒、PCR试剂盒均购自美国Sigma公司。PANDA-siRNA引物经上海GenePharma公司设计、合成，上游引物：5-CAGUUACCUGAUAGGCACTT-3，下游引物：5-UGGAUACUCAUGUACGUGTT-3。1.2细胞分组及钙化诱导干预处理方法取hVICs经37 水浴加热，缓慢加入间质细胞培养基10 mL，4 条件下 1 200 r/min离心 5 min。吸除上清，加入间质细胞培养基 2 mL 混匀并测定细胞计数。置于37、5%CO2培养箱中培养，每23 d更换一次培养液。取传至 5 代的 hVICs，以 1105/mL的细胞密度接种在6孔板上，分为正常对照组、钙化组和PANDA-siRNA组。正常对照组加入间质细胞培养基+10%胎牛血清，培养7 d。钙化组加入钙化诱导液进行钙化培养，包括-甘油磷酸（5 mmol/L）300 L/孔，L-抗坏血酸（50 g/mL）200 L/孔，地塞米松（100 nmol/L）100 L/孔，重组碱性磷酸酶（50 ng/mL）100 L/孔，培养7 d。PANDA-siRNA组使用无抗生素培养基进行培养，加入钙化诱导液，培养3 d；待细胞密度达到60%时，采用Lipofectamine3000 转染试剂盒转染 PANDA-siRNA，每天进行换液，培养4 d。1.3细胞LncRNA PANDA检测采用实时荧光定量PCR法。取三组细胞，加入TRIzol试剂提取细胞总 RNA，逆转录为 cDNA。以 cDNA 作为模板加入LncRNA PANDA 引 物，以 -actin 为 内 参，检 测LncRNA PANDA表达。LncRNA PANDA引物序列：上游引物 5-TCCCAACAAACAAGGGGTGG-3、下游引物5-GTGGCCAAAGGATCTGACGA-3；-actin引 物 序 列：上 游 引 物 5-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3、下 游 引 物 5-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3。采用2Ct法计算LncRNA PANDA相对表达量。1.4细胞形态观察取三组分组培养7 d的细胞，使用光学显微镜观察细胞形态。1.5细胞 NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2 蛋白检测采用Western blotting法。取三组分组培养7 d的细胞，加入细胞裂解液裂解，提取总蛋白，测定蛋白浓度。10 000 r/min进行离心5 min，取上清加入上样缓冲液，制备聚丙烯酰胺凝胶，将待测样品加入槽内，在80 V电压下电泳2 h。将电泳分离出的蛋白转入 PVDF 膜，室温环境下加入 5%脱脂牛奶封闭1 h。清洗 PVDF 膜后，加入 NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2及内参-actin一抗（稀释比例均为1 500），44山东医药2023 年第 63 卷第 23 期4 孵育过夜；再次清洗PVDF膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释比例均为1 5 000），室温孵育 1 h。进行抗体标记后曝光显影，Image J软件分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。1.6细胞上清液BMP-2蛋白检测采用ELISA法。收集三组分组培养7 d的细胞上清液，每组设3个复孔，每孔加样本50 L，室温孵育2 h，进行3次洗板。每孔加 BMP-2 抗体 200 L，避光条件下室温孵育2 h，清洗后加 200 L 底物，避光条件下室温孵育30 min。加入终止液后，使用全自动酶标仪检测450 nm波长下的光密度值，根据相应标准曲线计算BMP-2蛋白水平，严格按照BMP-2蛋白检测试剂盒说明书进行操作。1.7统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料采用 S-W 正态性检验，呈正态分布以-x s 表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，重复测量数据采用重复测量方差分析；非正态分布以 M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1三组细胞 LncRNA PANDA 相对表达量比较正常对照组、钙化组、PANDA-siRNA 组细胞 LncRNA PANDA 相对表达量分别为 14.62 3.21、22.23 2.18、5.12 1.22，组间两两比较 P 均0.05。2.2三组细胞形态比较PANDA-siRNA组细胞结构清晰，呈条索状生长，生长稍缓慢；钙化组细胞成骨样改变，细胞聚集，呈网状结构；正常对照组细胞贴壁生长，生长迅速。见OSID码图1。2.3三组细胞 NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2 蛋白相对表达量比较与正常对照组比较，钙化组细胞 NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2 蛋白相对表达量均 升 高，PANDA-siRNA 组 均 降 低（P 均 0.05）。见表 1、OSID码图2。2.4三组细胞上清液BMP-2蛋白水平比较正常对照组、钙化组、PANDA-siRNA组细胞上清液BMP-2蛋 白 分 别 为（42.37 5.42）、（90.59 8.23）、（20.16 2.72）pg/mL，组间两两比较P均0.05。3 讨论 近年来，主动脉瓣膜钙化及主动脉瓣膜狭窄的发病率呈逐年上升趋势，越来越多的老年患者因重度主动脉瓣狭窄而发生心力衰竭。随着经导管瓣膜置换术的推广，重度主动脉瓣膜狭窄等疾病的治疗也取得突破性进展，关于钙化性主动脉瓣疾病发生机制的相关研究越来越多6-7。hVICs是心脏瓣膜的重要构成细胞，在心脏瓣膜钙化的发生发展中起到至关重要的作用8。hVICs发生炎症、凋亡等均会诱发其成骨样改变，这是导致心脏瓣膜钙化的主要原因，其过程也受到多种基因的表达调控。随着LncRNA在心血管领域相关机制研究的不断深入，我们逐渐认识到LncRNA可以编码不足100个氨基酸的微肽，这些微肽广泛参与hVICs的炎症反 应 与 成 骨 样 改 变9-10。LncRNA PANDA 是LncRNA HOTAIR 之后，被证实参与 hVICs 钙化的LncRNA之一11-12。本研究结果显示，与正常对照组相比，钙化组LncRNA PANDA表达升高并发生成骨样改变；而 PANDA-siRNA 组 LncRNA PANDA 表达降低，细胞成骨样改变减轻；这说明在主动脉瓣的钙化过程中，细胞LncRNA PANDA表达升高，而降低LncRNA PANDA表达可减轻其钙化程度13。研究显示，LncRNA PANDA 通过 miR-27a-3p/叉头盒蛋白 O1（FoxO1）而抑制 hVICs的增殖，使下游组织金属蛋白酶抑制因子（TIMP）表达升高，导致炎症反应增加，反复刺激hVICs与心脏瓣膜内皮细胞基质碎裂化，抑制细胞泛素化与细胞降解，诱发细胞铁死亡的发生14。NF-YA为三聚体复合物，可与细胞表面死亡受体结合而发挥作用。当 LncRNA PANDA被敲除后，NF-YA在基因交互中作用减弱，细胞凋亡现象也随之减少6。NF-YA 存在三个亚基，其中大亚基A的作用是介导细胞炎症反应，小亚基 B可以激活凋亡相关蛋白 Bax，从而促进细胞凋亡15。Notch蛋白是跨膜蛋白受体超家族，其活化与Bax 蛋白表达及 NF-YA 的小亚基 C 作用相关16。NF-YA可直接促进转录因子p53结合到Notch2的启动子区域，从而促进Notch2表达17。另一方面，细胞炎症反应、凋亡小体的形成促进了凋亡相关蛋白Bax 表达，活化 Notch2 蛋白，并通过 NF-B 途径、JAK/STAT途径等促进hVICs分泌BMP-2，使其向成表1三组细胞NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2蛋白相对表达量比较（-x s）组别PANDA-siRNA组钙化组正常对照组NF-YA140.24 20.71*#580.34 50.81*377.12 30.52Bax130.91 18.72*#620.52 58.74*290.37 29.92Notch2181.42 22.73*#550.87 40.26*307.56 28.82BMP-2145.95 21.43*#578.94 45.67*293.52 29.14注：与正常对照组比较，*P0.05；与钙化组比较，#P0.05。45山东医药2023 年第 63 卷第 23 期骨细胞转化，加速瓣膜钙化的进程18。BMP-2为细胞分泌型蛋白，可在细胞培养液及血清中被检测到，目前常用的检测方法为ELISA法。血清BMP-2水平越高提示心脏瓣膜钙化程度越重，可使用该指标对钙化性主动脉瓣疾病的病情进行预测评估19-20。本研 究 结 果 显 示，钙 化 后 的 hVICs NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2表达升高，而抑制LncRNA PANDA表达的hVICs NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2表达降低；这说明LncRNA PANDA减轻hVICs钙化的机制可能与调控细胞凋亡和炎症反应有关，但具体的通路仍需进一步探讨，这也提示LncRNA PANDA有可能成为治疗钙化性主动脉瓣膜病的潜在靶点，为未来钙化性主动脉瓣膜病治疗药物的研发提供了新思路。参考文献：1胡盛寿，葛均波，韩雅玲，等.中国心血管健康与疾病报告2020要点解读 J.中国心血管杂志，2021，26（3）：209-218.2STEVEN J R，MARC R D，ELENA A，et al.Calcific aortic valve stenosis，hard disease in the heart，a biomolecular approach towards diagnosis and treatment J.Eur Heart J，2018，39（28）：2618-2624.3CLARK M B，MATTICK J S.Long noncoding RNAs in cell biology J.Semin Cell Dev Biol，2011，22（4）：366-376.4靳天慧，陈亮，宗刚军.非编码RNA在血管钙化中的调控作用J.心血管病学进展，2020，41（9）：938-942.5DONG J S，WU B，JIANG B.LncRNA SNHG7 promotes the proliferation and inhibits apoptosis of renal cell cancer cells by downregulating CDKN1A J.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2020，24（14）：7556-7557.6WEI H S，WANG Q，ZHOU Y，et al.Long noncoding RNA 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