以beta-tubulin基因为选择标记的淡紫紫孢菌遗传转化.pdf

DOI:10.12403/j.1001-1498.20230056以beta-tubulin基因为选择标记的淡紫紫孢菌遗传转化王曦茁1，汪来发1*，曹业凡1，胡坚1，汪祥1，覃艳2，王永春3(1.中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所，国家林业和草原局森林保护学重点实验室，北京100091；2.广西壮族自治区国有七坡林场，广西南宁530000；3.杭州益森键生物科技有限公司，浙江杭州310000)摘要：目的 建立稳定的食线虫真菌淡紫紫孢菌遗传转化体系，并获得插入突变体。方法 介导的方法，以淡紫紫孢菌 20-7 的分生孢子为受体，将新构建的携带 beta tubulin 基因的质粒转化进入淡紫紫孢菌的细胞中，通过优化诱导乙酰丁香酮（AS）的浓度、诱导培养时间、农杆菌终浓度OD660值、共培养AS的浓度、共培养时间和共培养温度等因子，建立高效遗传转化体系，获得致病力不同的突变体。结果 共培养过程中使用萌发孢子是成功建立淡紫紫孢菌遗传转化体系的必要条件；淡紫紫孢菌萌发的孢子与农杆菌 EHA105 在 25共振荡培养 48h 时，且在共培养阶段当乙酰丁香酮浓度为200gmL1（pH5.5）时转化效率最高，转化效率为 12003200 个转化子/106分生孢子，阳性抗性转化子比率为 96%；转化子 PCR 表明，T-DNA 已整合到淡紫紫孢菌的基因组中；Southern杂交验证表明，83.3%的转化子为 T-DNA单拷贝插入；成功建立了可靠的淡紫紫孢菌的遗传转化体系，并从 20 个转化子中筛选到 16 个致病力变异的突变体。结论 本研究成功构建了农杆菌介导的、以 beta-tubulin 基因为选择标记的淡紫紫孢菌高效遗传转化体系，并获得致病力变异的插入突变体，为淡紫紫孢菌的基因功能、致病机制研究及优良菌株选育奠定了基础。关键词：淡紫紫孢菌；根癌农杆菌；beta-tubulin；插入突变；致病力中图分类号：S718.81文献标识码：A文章编号：1001-1498(2023)04-0012-08作为一种典型的土壤习居丝状真菌，淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum(Thom)Luangsa-ard,Houbraken,Hywel-Jones&Samson）是最具潜力的植物寄生线虫生防真菌之一1-2，但它也同其它生防真菌制剂一样，存在着受环境影响较大、防治效果不稳定以及自身抗逆性较差等缺点3-4。目前无论是研究通过对生防菌株关键基因进行改造，达到提升生防菌制剂致病性和环境稳定性的目的5，还是研究生防菌对病原物的致病机制及它们之间的相互作用机制，都需要建立高效的遗传转化系统。农杆菌（Agrobacterium）介导的真菌转化已经在许多丝状真菌中得到广泛应用6-15，农杆菌介导的生防真菌转化也已有不少成功的实例，例如已成功实现了昆虫病原真菌白僵菌（Beauveriabassiana)10、绿僵菌(Metarhizium anisopliae)12和蜡蚧轮枝菌（Lecanicillium lecanii）15等生防真菌的遗传转化。真菌菌种的不同可以导致遗传转化效率不同16，另外转化载体和农杆菌菌株也可以影响遗传转化效率。G418 作为筛选标记建立的遗传转化体系达到了 10002400 个转化子/106分生孢子，遗传转化效率和抗性转化子比率偏低17。基于此，针对不同真菌的遗传转化体系其具体参数必须进行优化。beta-tubulin 基因是多菌灵的抗性收稿日期：2023-02-15修回日期：2023-04-21基金项目：国家林业局科技成果推广计划项目（201609）作者简介:王曦茁，硕士，副研究员，主要研究方向：森林病理学。电话：[phone].E-mail：*通讯作者:汪来发，博士,研究员，主要研究方向：森林病理学和林木线虫学.电话:[phone].E-mail：2023，36（4）：12-19林业科学研究http:/Forest Research基因，淡紫紫孢菌对多菌灵高度敏感，可用于抗性筛选。本文在前期研究的基础上，以 beta-tubulin 基因为筛选标记，对影响转化体系的一些参数，如诱导培养乙酰丁香酮（AS）的浓度、诱导培养时间、农杆菌终浓度OD660值、共培养AS的浓度、共培养时间和共培养温度等因子进行优化，以期建立了农杆菌介导淡紫紫孢菌高效遗传转化体系，并从中突变体库中筛选鉴定出致病力变异的突变体，从而为淡紫紫孢菌的致病机制研究及优良菌株选育奠定基础。1材料与方法1.1菌株和生长条件从 中 国 林 业 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心（CFCC）获得了强致病性菌株淡紫紫孢菌 20-7 和根癌农杆菌（A.tumefaciens）菌株 EHA105及 AGL-1。原始质粒 pBI-G3C 由日本京都府立大学 YasuyukiKubo 提供，带有苯菌灵的抗性基因beta-tubulin 的质粒 pCPXBN-1 由日本宫城大学SkinKasahara 提供，该基因被克隆后用来置换pBI-G3C 中的 hph（Apa I/Cla I）基因。LB 培养基、基本培养基（minimalmedium，MM）和诱导培养基（inductionmedium，IM）分别用于农杆菌划线培养、振荡培养和共培养前诱导17。PDA 培养基用于转化子的继代筛选和转化子保存。将混和后的农杆菌和淡紫紫孢菌孢子铺在共培养培养基（0.8mL1.25molL1K-buffer（pH4.9），20mLM-N，1mL10mgL1CaCl22H2O，5 mL Spore Elements，2.5 mL 200 mgL1NH4NO3，10 mL 500 mgL1甘 油（glycerol），40mL1molL1MES（pH5.5用NaOH调节pH值），10mL200mgL1葡萄糖(glucose)，2mL100gmL1AS，加蒸馏水定容至 1L）上进行转化。链霉素（浓度50gmL1）和卡那霉素（浓度 10gmL1）用于振荡培养农杆菌；头孢噻肟钠（浓度 200gmL1）和苯菌灵（浓度 300gmL1）用于转化子筛选。1.2表达载体的构建1.2.1选择标记基因的克隆根据设计的保守引物，采用 PCR 方法从 pCPXBN-1 载体中扩增beta-tubulin 基因，胶回收后 T 载体过夜连接，连接产物转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，涂在附加 60gmL1氨苄青霉素（amp）的 LB 固体平板上筛选重组菌株。重组菌株质粒 DNA 碱法小量提取的步骤见文献18。1.2.2质粒构建在 beta-tubulin 引物端对 Apa I和 Cla I 酶切位点进行双酶切，用 T4DNALigase连接回收酶切后的 DNA 片段。连接产物转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，构成表达载体 pBI-G3C-BN。PCR 检测转化后的重组子。重组菌株质粒DNA 碱法小量提取的步骤同上。1.3淡紫紫孢菌遗传转化体系的建立为了确定农杆菌介导淡紫紫孢菌遗传转化体系的最佳条件，本体系是在已建立的转化淡紫紫孢菌方案17基础上修改而成。1.3.1淡紫紫孢菌 20-7 菌株抗苯菌灵最佳浓度的筛选为了评估淡紫紫孢菌对苯菌灵的敏感性，淡紫紫孢菌 20-7 菌株生长在 PDA 培养基上，该培养基添加了不同浓度的苯菌灵（0、100、200、300、400、500 和 1000gmL1）。在 25 下培养 3 个独立的培养物。分别于培养后 48、72、96 和 108h 观察菌落生长情况，经 5 次继代培养，筛选抗性稳定的菌株转接到 PDA 培养基（苯菌灵50gmL1）斜面上保存。1.3.2最佳转化条件的筛选为了确定最佳共培养条件，根据 20-7 菌株的不同生长时期（4保藏 30d 和新鲜菌株）、农杆菌菌株转化效率（EHA105 和 AGL-1）、农杆菌悬浮液浓度（OD660值为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7）、乙酰丁香酮浓度（100，200，500 和 1000gmL1）、20-7 菌株与农杆菌菌株的共培养时间（24、48、72和96h）、培养温度（22、25、28 和 31）和 pH（5.0、5.5和6.0）来进行筛选，每种条件设置 3 个重复。采用两种共培养方式：A.等体积混 合 EHA105 菌 液 和 20-7 孢 子 悬 浮 液（106个mL1），于 28 摇床振荡（140rmp）培养 14h 后，将混合物涂布在含有 200gmL1的头孢噻肟钠和 300gmL1的苯菌灵 PDA 培养基上，用于筛选转化子。置于 25 培养箱中培养 35d；B.将等体积混合的 EHA105 菌液和20-7 孢子悬浮液（106个mL1）涂布在共培养平板上的无菌滤纸条上，在 25 下避光培养 72h。揭 下 滤 纸 条，反 铺 到 PDA 培 养 基（含 200gmL1头孢噻肟钠和 300gmL1苯菌灵）上，第4期王曦茁，等：以 beta-tubulin 基因为选择标记的淡紫紫孢菌遗传转化1325培养 48h。对每个平板中的真菌菌落进行计数和统计分析。1.4抗性菌株的筛选1.4.1筛选培养及抗性稳定测定挑取抗性单菌落，至 PDA 平板（含 200gmL1头孢噻肟钠和300gmL1苯菌灵）上，25 下恒温培养，再进行筛选。7d 后，单孢分离有孢子产生的转化子，单孢转接到 PDA（含苯菌灵300gmL1和头孢噻肟钠200gmL1）培养基上进行筛选；具体筛选步骤参考王曦茁等17，经 5 次筛选的抗性菌株转接到 PDA 斜面培养基（含 300gmL1苯菌灵）上保存。1.4.2转化子的 PCR 检测转化子总 DNA 的提取及农杆菌 Ti 质粒 DNA 的碱法小量提取步骤参照植物基因工程原理与技术18。随机挑选 100个转化子进行 PCR 验证。引物序列为 Tub-FWD（GGGCCCTCGAGAGGGGGCCTTCCACCCTTC）和 Tub-REV（ATCGATTAGAGGATCCCCGGGGGATCC-AGA），其中下划线表示 Apa I 和 Cla I酶切位点。扩增反应程序参考王曦茁等文献17，根据扩增反应结果来确定 T-DNA 是否插入到淡紫紫孢菌基因组内。1.4.3转化子的 Southern 杂交分析取 PCR 阳性的转化子参考分子克隆实验指南第三版的方法19提取基因组 DNA，用 HindIII 酶切，37 过夜，pCPXBN-1 质粒 DNA 用 HindIII 酶切作为阳性对照。酶切后的 DNA 在 0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离。DNA 印迹转膜、洗涤、预杂交、洗膜、显影以及探针标记等参考文献20。1.5转化子的稳定性1.5.1转化子的遗传稳定性测定随机选取 20 株转化子菌丝到含有苯菌灵的 PDA 培养基上，25下培养 7d 后，再连续转接 5 次。观察和记录转化子的菌落形态和生长状况等表型特征，分析确定其遗传稳定性。1.5.2转化子对对南方根结线虫（Meloidogyneincognita）虫卵的致病力测定按照常规方法获得南方根结线虫（M.incognita）虫卵21。在直径 6cm 的 培 养 皿 中 加 入 300 L 卵 悬 液(1 000个mL1)，然后分别加入 3mL 的 20 个随机选取转化子的孢子悬浮液（1.0106个mL1），并以原始菌株 20-7 作为对照。4d 后统计卵的寄生和未寄生数目，计算转化子对南方根结线虫虫卵的寄生率。2结果与分析2.1质粒 pBI-G3C-BN 的构建构建质粒 pBI-G3C-BN 的示意图见图 1，将原有质粒 pBI-G3C 中的 hph 基因置换为 beta-tubulin基因，beta-tubulin 基因从质粒 pCPXBN-1 上扩增获得。LBbeta-tubulinoribeta-tubulinpCPXBcmhphCoIE I oriRBLBpBI-G3C12 000 bpOriVNPTHIcmbeta-tubulinColE I oriRBLBOriVbeta-tubulinpBI-G3C-BNApa ICla ITrfATraFXba IApa ICla IXba IApa ICla ITraFTrfAz图1载体构建示意图Fig.1Schematicdiagramofcarrierconstruction2.2遗传转化体系的建立2.2.1苯菌灵最佳浓度的筛选淡紫紫孢菌菌株20-7 菌落生长与 PDA 培养基中苯菌灵浓度密切相关，浓度越大，生长越受抑制。当苯菌灵浓度达到 300gmL1以上时，完全抑制菌落生长（表 1）。2.2.2淡紫紫孢菌孢子新鲜程度对转化率的影响淡紫紫孢菌孢子新鲜程度不同，对其遗传转化率有所影响。当 AS 浓度 200gmL1，苯菌灵的筛选浓度为 300gmL1时，新鲜孢子的转化率比保存一个月后的孢子转化率约增长 15 倍（表 2）。2.2.3乙酰丁香酮浓度对淡紫紫孢菌转化效率的影响乙酰丁香酮 AS 浓度对淡紫紫孢菌转化效率影响明显，当 AS 浓度为 200gmL1到 100014林业科学研究第36卷gmL1时，转化效率均较高（图 2）。从节约成本出发，选用 AS 浓度在 200gmL1到 500gmL1为宜。01002001 000500dcaba01 5005001 0002 0002 5003 5003 0004 000转化子个数Transformants/(10-6)Acetosyringone concentrations/(molL-1)图2乙酰丁香酮浓度对淡紫紫孢菌 20-7 转化效率的影响Fig.2EffectsofdifferentacetosyringoneconcentrationsonthetransformationefficiencyofP.lilacinum20-72.2.4根癌农杆菌菌株和浓度对淡紫紫孢菌转化效率的影响农杆菌菌株 EHA105 和 AGL-1 在相同的试验条件下，对淡紫紫孢菌 20-7 菌株进行遗传转化的效率存在较大差异。农杆菌菌株 AGL-1 的所有生长浓度(OD660)均能对淡紫紫孢菌进行有效转化，而农杆菌菌株 EHA105 的生长浓度(OD660)在 0.4 以上时，遗传转化率较高。因此，农杆菌菌株及浓度的不同均能影响淡紫紫孢菌遗传转化率。EHA105 生长浓度 0.6 时，转化效率最高，明显高于 AGL-1 的转化率（图 3）。0.10.20.40.70.60.30.5ffddedghecba01 5005001 0002 0002 5003 5003 000转化子个数根癌农杆菌生长浓度AGL-1cTransformants/(10-6)Growth concentration of A.tumefaciens(OD660)EHA105图3农杆菌菌株浓度对淡紫紫孢菌 20-7 转化率的影响Fig.3EffectsofdifferentAgrobacteriumstrainsontheconversionrateofP.lilacinum20-72.2.5共培养方法的筛选结果2.2.5.1共培养的酸碱度、温度、时间对转化效率的影响在相同的试验条件下，共培养培养基的酸碱度、共培养时间和温度都对转化效率有影响。酸 碱 度、时 间 和 温 度 分 别 为 pH5.5、48 h 和25 时转化效率最高（图 4、图 5 和图 6）。5.05.56.0cab01 5005001 0002 0002 5003 5003 0004 000转化子个数酸碱度PHTransformants/(10-6)图4pH 对淡紫紫孢菌 20-7 转化效率的影响Fig.4EffectofpHontransformationefficiencyofP.lilacinum20-72.2.5.2共培养方式对遗传转化效率的影响不同的共培养方式，转化效率不同，EHA105 菌液24489672ccab01 5005001 0002 0002 5003 5003 0004 000转化子个数时间Time/hTransformants/(10-6)图5时间对淡紫紫孢菌 20-7 转化效率的影响Fig.5EffectoftimeontransformationefficiencyofP.lilacinum20-7表1苯菌灵浓度对淡紫紫孢菌 20-7 菌落生长的影响Table1EffectsofdifferentconcentrationsofbenomylonthegrowthofP.lilacinum20-7浓度Concentration/(gmL1)20-7菌落直径/cmThecolonydiameterofP.lilacinum/cm48h72h96h108h02.115.137.579.121000.340.831.461.942000.010.030.040.0630000004000000500000010000000表2淡紫紫孢菌 20-7 菌株孢子新鲜程度对转化效率的影响Table2EffectsofdifferentdegreeofsporefreshnessontransformationefficiencyofP.lilacinum20-7孢子新鲜程度Sporesfreshness转化子个数Transformants/(106)保存一个月的孢子Sporessavedforamonth187新鲜孢子Freshspores3019第4期王曦茁，等：以 beta-tubulin 基因为选择标记的淡紫紫孢菌遗传转化15和 20-7 孢子悬浮液混合振荡培养的转化效率约是混合液直接涂在滤纸上转化效率的 1.6 倍（表 3）。表3共培养方法对淡紫紫孢菌 20-7 转化效率的影响Table3Effectsofdifferentco-culturemethodsontransformationefficiencyofP.lilacinum20-7共培养方法Co-culturemethod转化子个数Transformants/(106)振荡培养Shakethemedium3208涂于滤纸片上Coatonfilterpaper19482.3转化子的鉴定提取随机选择 100 个的转化子、质粒 pBI-G3C-BN 和原始菌株基因组 DNA，并将质粒 pBI-G3C-BN 和原始菌株基因组 DNA 用作 PCR 研究的参考。使用 beta-tubulin 基因特异性引物进行扩增，从 96 个转化子和阳性对照中获得了约 2.2kb 的序列，证明苯菌灵基因已整合到 20-7 转化子的基因组中；而同时观察到 4 个转化子没有条带，可能为假阳性，图 7 为随机选取的 8 个 T20-7 菌落 PCR 结果。2.4Southern 杂交从根癌农杆菌介导转化体系突变体库中随机选取的 12 个转化子中，每个转化子都有不一致的Southern 杂交带，说明 T-DNA 是随机整合的。有 10 个转化子是单一杂交带，表明这 10 个转化子 T-DNA 插入是单拷贝的，占 83.3%。另外 2 个转化子（6 号和 9 号）有两条杂交带，说明这2 个转化子其 T-DNA 插入为多拷贝，占 16.7%（图 8）。2.5转化子对苯菌灵抗性的稳定性在 PDA（苯菌灵300gmL1）平板上接种原始菌株 20-7 和转化子 72h 后，转化子 T20-7 菌落扩展 2cm 左右，而 20-7 菌落没有扩展，被苯菌灵抑制。T20-7 连续培养共 5 代，仍然不被苯菌灵抑制，从而表明转化子 T20-7 对苯菌灵的抗性稳定遗传。2.6转化子对南方根结线虫的致病力影响随机选取的 20 个转化子对南方根结线虫卵寄生率测定表明：仅 1 个转化子对南方根结线虫卵的寄生率显著增大，卵寄生率为 86.67%，比野生型菌株 20-7 的卵寄生率 67.64%提高了 19.03%；而 15 个突变体侵染卵的效果明显下降，转化子最低寄生率为 20.12%，与野生型菌株 20-7 相比下降了 47.52%，结果最为显著（P=0.05）；仅有4 个突变体的致病力与 20-7 相比并无显著性差异（图 9）。22253128bbaa01 5005001 0002 0002 5003 5003 0004 000转化子个数温度Transformants/(10-6)Temperature/(C)图6温度对淡紫紫孢菌 20-7 菌株转化效率的影响Fig.6EffectoftemperatureontransformationefficiencyofP.lilacinum20-72 000 bp3 000 bp5 000 bpM12345678CK+CK注：泳道从左到右编号 1-8 分别为转化子；CK+：质粒 pBI-G3C-BN；CK-：野生型 20-7；M：D2000DNAMarkerNotes:Lanesnumbered1-8fromlefttorightaretransformer;CK+:plasmidPBI-G3C-BN;CK-:wild-type20-7;M:D2000DNAMarker图7淡紫紫孢菌 20-7 转化子的 PCR 检测Fig.7PCRdetectionofTransformantsofP.lilacinum20-7M1WT2345678910 11 12注：WT：野生型菌株；1-12：ATMT 转化子Notes:WT：Wildtypestrain；1-12：ATMTgeneratedtransformants图8转化子 Southern 杂交验证 T-DNA 插入位点及拷贝数Fig.8SouthernblottingofrandomlyselectedtransformantsfortheT-DNAinsertion16林业科学研究第36卷3讨论根癌农杆菌介导转化法具有转化效率高、遗传稳定、适用范围广等诸多优点，已成为真菌遗传转化研究中的强有力手段，在真菌基因资源开发、真菌性疾病研究和外源蛋白表达研究中发挥巨大作用7，到 2020 年，已经对 100 余种真菌进行了遗传转化22，但此种方法仍有不足之处，在真菌中的应用不完全成熟，如农杆菌种类、共培养温度及时间等众多因素都会对转化效率产生影响，不同菌株甚至同一菌株不同受体材料之间转化效率差异较大，限制了该技术的推广使用23。在本研究中，淡紫紫孢菌萌发的孢子与农杆菌 EHA105 在 25共振荡培养 48h 时，且在共培养阶段当乙酰丁香酮浓度为200gmL1（pH5.5）时转化效率最高。对于根癌农杆菌介导淡紫紫孢菌遗传转化，筛选标记对抗性菌株的比例有很大影响。以膦丝菌素乙酸转移酶(bar)基因作为选择标记建立的淡紫拟青霉的遗传转化体系24，57%的抗性转化子 PCR检测为阳性；以大肠杆菌转座子 Tn903编码的氨基糖苷磷酸转移酶(G-418)基因作为筛选标记，79%抗性转化子的 PCR为阳性17，而本研究以beta-tubulin 基因为筛选标记，96%抗性转化子的PCR 为阳性，通过比较说明选择合适的标记对转化子的筛选尤为重要，本研究证明，beta-tubulin基因作为选择标记适合淡紫拟青霉的遗传转化。淡紫紫孢菌的遗传改良主要是以提高生防效率为目标，本研究在利用根癌农杆菌介导转化体系成功转化的淡紫紫孢菌转化子库中，成功筛选到了致病力发生变化的转化子，而高致病力强的菌株有可能作为优良菌株用于实际生产；由于其带有 beta-tubulin 基因，对杀菌剂苯菌灵具有抗性，提高了淡紫紫孢菌的生态适应性和应用性，对协调生物防治与化学防治，以及提高淡紫紫孢菌杀线虫剂的应用效果均具有重要的科学意义和应用价值。4结论本研究构建了农杆菌介导的、以基因 beta-tubulin 为选择标记的淡紫紫孢菌高效遗传转化体系，成功将携带beta-tubulin 基因的 T-DNA 整合到淡紫紫孢菌基因组中，转化菌株对苯菌灵的抗性可正常表达且稳定遗传，还获得了致病力变异的插入转化子，为淡紫紫孢菌的致病机制研究及优良菌株选育奠定了基础。参考文献：KERRY B R.An assessment of progress towards microbialcontrolofplantparasiticnematodesJ.JournalofNematology,1990,22:621-631.1 ZHANGSW,GANYT,XUBL.BiocontrolpotentialofanativespeciesofTrichoderma longibrachiatumagainstMeloidogyneincognitaJ.AppliedSoilEcology,2015,94:21-29.2 GINEA,SORRIBASFJ.EffectofplantresistanceandBioActWG(Purpureocillium lilacinumstrain251)onMeloidogyne in-cognita in a tomato-cucumber rotation in a greenhouseJ.PestManagementScience,2017,73（5）:880-887.3 KOOLIYOTTILR,DANDURAND L M,KNUDSEN G R.Pro-specting fungal parasites of the potato cyst nematodeGlobodera pallidausingarapidscreeningtechniqueJ.Journ-4 20-7pbt1pbt2pbt3pbt4pbt5pbt6pbt7pbt8pbt9pbt10pbt11pbt12pbt13pbt14pbt15pbt16pbt17pbt18pbt19pbt20cdcdcccdcdcdcdcdcdcdddddabbbbb0301020405070809060100转化子个数菌株StrainTransformants/(10-6)图9不同转化子对南方根结线虫卵寄生率Fig.9ParasiticrateoftransformantsofP.lilacinumagainstM.incognitaeggs第4期王曦茁，等：以 beta-tubulin 基因为选择标记的淡紫紫孢菌遗传转化17alofBasicMicrobiology,2017,5（57）:386-392.柯心如,刘登艳,谭建彬,等.一株淡紫紫孢菌的分离、鉴定及生物学特性研究J.广东农业科学,2022,49（6）：108-117.5 GROOTMD,BUNDOCKP,HOOYKAASP,et al.Agrobacteri-um tumefaciens-mediatedtransformationoffilamentousfungiJ.NatureBiotechnology,1998,16（9）:839-42.6 FURLANETOMC,PAIOFG,PINTOFGS,et al.Transform-ationoftheentomopathogenicfungusMetarhizium flavoviridetohighresistancetobenomylJ.CanadianJournalofMicrobi-ology,1999,45:875-878.7 MULLINSED,CHENX,ROMAINEP,et al.Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum:an efficienttoolforinsertionalmutagenesisandgenetransferJ.Phyto-pathology,2001,91:173-180.8 ROGERS C W,CHALLEN M P,GREEN J R,et al.Use ofREMI and Agrobacterium-mediated 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lilacinumbyUsingbeta-tubulinasSelectableMarkerWANG Xi-zhuo1,WANG Lai-fa1,CAO Ye-fan1,HU Jian1,WANG Xiang1,QIN Yan2,WANG Yong-chun3(1.KeyLaboratoryofForestProtectionofNationalForestryandGrasslandAdministration,EcologyandNatureConservationInstitute,ChineseAcademyofForestry,Beijing100091,China;2.QipoForestFarm,Nanning530000,Guangxi,China;3.HangzhouYisengjianBiotechnologyCo.,LTD.,Hangzhou310000,China)Abstract:PurposeToestablishanefficienttransformationsystemofthenematopathogenicfungusPur-pureocillium lilacinumandobtainitsinsertionalmutagenesis.MethodsThebenomylresistancegenebeta-tubulinbeingastheselectivemarker,Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationtechniquewasdevelopedtoscreendifferentpathogenicitymutantsinP.lilacinum.PCRamplificationandSouthernhybridizationwereusedtoverifythetransformationevents,andSouthernblottingofbeta-tubulingeneandcloningoftransformingDNA(T-DNA)flankingsequenceswereusedtodetermineinsertnumberandsiteofT-DNAinthefungalgenome,respectively.ResultsAreliabletransformationmethodwasestablishedforP.lilacinum.Specifically,pre-germinatingsporesofP.lilacinumusedatco-cultivatedperiodwasapre-requisiteP.lilacinumgerminatingsporesco-cultivatedwithA.tumefaciensEHA105at25for48hachievedthehighesttransformationefficiency,whichwas1200-3200transformantsper106spores,andtheratioofpositiveresistanttransformantswas96%.Thetransformantswerecultivatedupto5genera-tionsonbeta-tubulin-containingmediumandconfirmedbyPCRandthosegenetictrai