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分子细胞遗传学诊断技术简介 u荧光原位杂交技术（荧光原位杂交技术（FISH)FISH)快速产前诊断快速产前诊断常见非整倍体常见非整倍体u荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术(FISH)(FISH)诊断诊断DiGeorge/VCFSDiGeorge/VCFS综合征综合征u光谱核型分析技术（光谱核型分析技术（SKY)SKY)检测染色体异检测染色体异常常uaCGHaCGH快速检测间期细胞全基因组拷贝数快速检测间期细胞全基因组拷贝数荧光原位杂交技术快速产前诊荧光原位杂交技术快速产前诊断常见非整倍体断常见非整倍体项目概述 出生缺陷是影响人口素质的重大问题，每年估计有80100万出生缺陷儿诞生，给家庭和社会带来沉重的负担。70%的出生缺陷是遗传因素所致，染色体非整倍体异常最常见，如常染色体异常13、18、21 三体等及性染色体异常 Turner 综合征、Klinefelter 综合征等。其中最常见的是21三体综合征又称唐氏综合征(DS)，新生儿的发病率高达1/800。项目概述 产前诊断是避免异常患儿出生的的重要技术手段。传统的核型分析方法是国内外公认诊断染色体病的金标准。然而,标准的核型分析必须对细胞经过数天培养，耗时过长，操作复杂。FISH 解除了传统细胞学的限制，能够在短至24小时的时间排除占活婴染色体异常的95%的五种常见异常，对于检查者无疑是一大福音。适应症u（1）孕妇年龄大于等于35岁。u（2）孕妇曾经生育过染色体异常患者史。u（3）夫妇一方有染色体结构异常者。u（4）母血清生化筛查高风险。u（5）超生检查发现胎儿异常。技术原理 荧光原位杂交技术（flourescence in situ hybridization FISH）为分子生物学（探针）与细胞遗传学（染色体）的结合。FISH技术是指将荧光标记的染色体区带特异性的DNA作为探针，与分裂期或间期细胞原位杂交于荧光显微镜下观察染色体畸变的技术。技术优势 重复性好、稳定；高灵敏性及特异性；可用于间期细胞，不需要细胞培养；目前，FISH已成为一种常见检测手段，国外广泛地用于产前、产后遗传病诊断及血液肿瘤、实体瘤等方面的检测。在欧美发达国家应用FISH产前诊断检测染色体异常占30-40%。技术原理与方法 产前诊断检测非整倍体需要21、13、18、X和Y染色体上的五种探针。其中21号和13号染色体检测探针列为一组，为位点特异探针，分别用Rhodamine(红色和FITC(绿色)标记。18号、X和Y染色体探针列为一组，为染色体着丝粒特异性重复序列探针,分别用DEAC(蓝色)FITC(绿色)和Rhodamine(红色)标记。检测正常结果 异常结果 21三体 18三体技术难点 试剂的离子成分和PH值对杂交的好坏有直接的影响。因而在实验的试剂配置准备过程中要注意使用超纯水进行配置，同时配好的试剂要使用PH试纸或PH仪校准。细胞质较多时也会引起杂交率低下，信号弱，因而在实验操作时应特别注意消化时间的掌握。荧光原位杂交技术检测荧光原位杂交技术检测DiGeorge/VCFSDiGeorge/VCFS综合征综合征临床指征（包括儿童及胎儿）圆锥动脉干畸形,如法洛四联症,肺动脉闭锁/室间隔缺损,右室双出口,永存主动脉干,以及B 型主动脉弓离断；异常面容；胸腺发育不良；腭裂；低钙血症；DiGeorge/VCFSDiGeorge/VCFS综合征综合征 DiGeorge/VCFS 综合征临床特征包括心脏畸形（锥干部畸形为主）、T细胞功能缺陷、腭裂、异常面容和低钙血症。该综合征涉及多个基因的缺失,而TBX1基因可能是主要致病基因。这些基因的丢失影响了胚胎期心脏神经嵴细胞的正常功能,从而造成出生后神经嵴相关组织(胸腺,腭,圆锥动脉干)的畸形。DiGeorge/VCFSDiGeorge/VCFS综合征综合征 DiGeorge 综合征或 Velocardiofacial（VCFS)综合征，是由于22号染色体长臂近着丝粒端微片段缺失引起的遗传综合征。在活产胎儿儿中发生率约1/4 000，是造成小儿先天性心脏病最常见的单一基因因素。群体检测证实近90DiGeorge综合症病人和约85VCFS综合症病人存在22q11微缺失。项目概述 目前世界上唯一有效的方法就是手术治疗。DiGeorge/VCFS综合征综合征除了先心病（CHD）最容易早期发现外，其他异常(如低钙血症、细胞免疫功能缺陷、气管支气管畸形等)则相对隐匿。此类CHD患者如不能早期诊断与适当干预，手术时则可能发生难以预测的感染、心脏停搏、呼吸衰竭等，手术风险大大增加，预后不良。因此，如能通过本项目确诊早期干预，其社会和经济效益是显而易见的。项目概述 此外，该综合征还经常合并智力障碍及认知功能障碍和精神行为异常，严重影响生活质量，给社会和家庭造成的经济和精神损失是巨大的。为此常推荐终止妊娠。进行22q11 微缺失检测，可以帮助准确产前咨询，为孕妇决定终止妊娠提供全面充分的证据。目前国外此项检查常规开展，国内也有部分单位已经开展。技术方法 检测DiGeorge/VCFS综合征需要22号长臂上的一组探针，分别为GLP TUPLE1和GLP ARSA。该方法只能检测出DiGeorge/VCFS综合征最常见的缺失，对于少数患者发生其他缺失或易位不能检出。应用范围及意义通过羊水检测判断胎儿发生先心病的情况。检测患有先心病的新生儿及儿童，明确病因。生育过先天性心脏病患儿父母进行检测，可以预测下一胎儿患先心病的可能性。光谱核型分析技术检测染色体异常光谱核型分析技术检测染色体异常项目概述项目概述 染色体畸变80%为染色体数目异常，其次为染色体结构重排、丢失、重复、平衡或非平衡易位、嵌合体、标记染色体等。染色体病患者大多有严重的智力障碍、生长发育迟缓和某些组织器官畸形等，同时染色体畸变也是导致妊娠早期自然流产和不孕不育的重要原因，且目前尚无有效地治疗方案。准确地对染色体病进行诊断和产前诊断，有利于控制出生缺陷，指导遗传咨询和评估预后。项目概述项目概述传统的染色体畸变诊断方法为G显带染色体核型分析，可以观察染色体的数目和整套染色体的主要带形，其分辨率约为350450个染色体条带。但对于标记染色体（来源不明的染色体）、复杂的染色体易位或重排，以及微小的染色体结构畸变则难以进行准确的分析。项目概述项目概述光谱核型分析技术（spectral karyotyping,SKY）是1996年发展起来的一种将光谱干涉成像技术与FISH相结合的细胞遗传学检查的新技术；使24种染色体同时以不同的颜色显示出来，染色体之间的易位可以很直接地观察到；SKY的分辨率较高，可达1.5Mb DNA；而常规的G显带核型分析技术对小于5-10Mb DNA则难以分辨了。项目概述项目概述 SKY在诊断标记染色体、复杂的染色体易位或重排，以及微小的染色体结构畸变等方面有较大的优势，逐渐在临床疑难染色体病的诊断和产前诊断、植入前遗传学诊断以及肿瘤遗传学领域得到了广泛应用,为临床染色体病的诊断、处理、预后评估和遗传咨询提供依据。适应症常规G显带染色体检查显示复杂染色体易位、标记染色体、衍生染色体；具有临床表现而常规核型分析技术未发现异常的病例禁忌症对于一条染色体中发生的倒位、重复、缺失，因无色彩的变化，SKY不能直接检出；不能精确判断染色体畸变的断裂点（即区带）；光谱核型分析技术（spectral karyotyping,SKY）基本原理 用5种不同的荧光素或其组合标记出不同的24种人类染色体涂染探针，然后将不同标记的24种探针同时与中期染色体进行原位抑制杂交。通过Fourier分光镜、CCD成像和光学显微镜捕捉和测量所有染料被激发后产生的发射光谱，按照一种光谱分类算法将一特定的分类色（假颜色）分配到所有的人类染色体上，然后通过计算机成像软件分析，使不同的染色体显示出不同的假颜色，从而进行核型分析。t(9;11)G-bandG-bandSKYSKY技术难点 玻片标本质量的好坏和玻片变性时间的控制是SKY实验成功的关键。制备本底干净、核型分布好、没有胞浆的标本，选择较好的变性时间。技术局限 对微小的标记染色体进行检测时，由于荧光闪烁可能会出现颜色混杂现象，需要相应的FISH进行进一步鉴定，以明确诊断。试剂及设备成本高。aCGHaCGH快速检测间期细胞全基因快速检测间期细胞全基因组拷贝数组拷贝数21世纪细胞遗传学的革命 aCGH简称：aCGH英文名：array-comparative genomic hybridization；Microarray based Comparative Genomic Hybridization）中文名：微阵列-比较基因组杂交aCGH适用范围aCGH将作为染色体分析的一种选择方法，替代FISH和许多标准染色体组型分析，其也可用于检测各种样本上的拷贝数变化。aCGH是一种高尖端技术，广泛应用于产前和产后诊断、植入前诊断、癌症诊断和预后、个体化治疗、干细胞和细胞系研究、药物发现等领域。aCGH 革命 主观的主观的G-Banding“低”分辨率 全基因组=+=高分辨率 FISH=+靶基因=劳动强度大，劳动强度大，耗时耗时 客观的客观的全基因组 高分辨率 aCGH=+=aCGH工作流程步骤1：从质控和实验组织上提取基因组DNA。必要时扩增。步骤2：使用青色素-3 dCTP和青色素-5dCTP以 区分标记检测DNA和参考DNA。步骤3：将标记DNA与芯片R杂交。步骤4：使用扫描仪和软件对芯片信号进行扫描和分析。试验方案要求时间为小于两个工作日。结果可在36hr内收到。不需要细胞培养，也不需要在载玻片上进行冗长的中期染色体制备。工作原理示意图直接比较两个经过不同标记基因组之间DNA拷贝数的差异。a CGH 提供客观和定量的结果SpectralWare software provides a visual representation of the data generated from the microarray Perkinelmer a CGH 技术-靶阵列或全基因组阵列设计，您的选择！Targeted aCGHTargeted aCGH 对已知病症提供清晰的对已知病症提供清晰的信号信号避免实验室反复用避免实验室反复用FISH 方方法来进行实验诊断法来进行实验诊断结果易懂结果易懂将错失不覆盖区域的基因将错失不覆盖区域的基因缺失和增加缺失和增加如果病人有明显的综合病如果病人有明显的综合病症，染色体分析或症，染色体分析或FISH 可可能更适合能更适合Whole genome Whole genome aCGHaCGH广泛覆盖基因，广泛覆盖基因，1MB分分辨率辨率发现新易感基因发现新易感基因更多的噪信号更多的噪信号数据难以解释和理解数据难以解释和理解靶向芯片的临床应用在实际的临床分子细胞遗传学领域中，靶向微阵列最受欢迎，因为它基本涵盖基因组中所有已知的重大临床意义的特定区域，在应用中可以达到最佳的平衡：最大限度地检测与临床有关的染色体不平衡异常，又能够尽可能地减少涵盖人类基因组中多态性拷贝数变异（CNVs）的数量。靶向芯片可检测40几种微缺失综合征1p36先天性肾上腺发育不良症先天性肾上腺发育不良症Alagille综合征综合征安琪儿综合征安琪儿综合征无精子因子无精子因子A无精子因子无精子因子B无精子因子无精子因子CBruton酪氨酸激酶酪氨酸激酶巨大舌巨大舌-脐膨出综合征脐膨出综合征1A型腓骨肌萎缩症型腓骨肌萎缩症猫鸣症侯群猫鸣症侯群DiGeorge 1/VCF综合征综合征DiGeorge 2=10p13唐氏综合征唐氏综合征Duchenne肌肉萎缩症肌肉萎缩症甘油激酶缺乏症甘油激酶缺乏症Greig综合征综合征 GLI3遗传性压迫易感性神经病遗传性压迫易感性神经病甲状旁腺功能不全、感音神经性聋和肾发育不良甲状旁腺功能不全、感音神经性聋和肾发育不良卡尔曼综合征卡尔曼综合征Langer-Giedion综合征综合征 EXT1 andTRPSI敏敏-迪综合征迪综合征Potocki-Shaffer症侯群症侯群包括多发性外生软骨瘤包括多发性外生软骨瘤2神经纤维瘤病神经纤维瘤病1佩佩-梅病梅病I型多囊肾疾病型多囊肾疾病Prader-Willi综合征综合征视网膜母细胞瘤视网膜母细胞瘤1Rubinstein-Taybi氏症侯群氏症侯群Saethre-Chotzen综合征综合征Y染色体性别决定区染色体性别决定区Smith-Magenis综合征综合征Sotos综合征综合征固醇硫酸酶缺乏症固醇硫酸酶缺乏症毛发毛发-鼻鼻-指指（趾趾）综合征综合征结节性硬化症结节性硬化症1威廉斯综合征威廉斯综合征肾母细胞瘤肾母细胞瘤威尔姆氏肿瘤威尔姆氏肿瘤Wolf-Hirschhorn症侯群症侯群a CGH 优越性：一种极高的分辨率的染色体分析方法，提供G-带分型不可能的结果只需要小于1g的DNA样本使得对染色体制备困难或不可能的样本分析容易，无需细胞培养，出结果少于两天 提供客观和自动分析的结果可靠地检测出全染色体组所有的不平衡异常、全基因组所有DNA拷贝数的异常 技术局限性价格昂贵不能发现没有伴发DNA拷贝数变化的平衡染色体畸变，例如罗伯逊易位，平衡的相互易位，平衡的插入和倒位等。非致病性的DNA拷贝数比变异（CNV）至少累及人类基因组的12%(16)，因此array-CGH结果的解释也面临一些挑战，染色体不平衡并不意味着就具有致病性。谢谢！